Производство большого количества Размер контролируемой опухолевых сфероидов Использование микролунках планшета

Общая цель следующего эксперимента состоит в том, чтобы получить большое количество опухолевых сфероидов с одинаковым размером. Это достигается путем предварительной подготовки микролуночных планшетов для кластеризации клеток, которые должны быть сформированы в стероиды. На втором этапе собирают культуру желаемого типа клеток, которая обеспечивает клеточную суспензию, определяющую размер и состав OIDs.

Затем клеточную суспензию центрифугируют в микролунках и инкубируют, чтобы позволить стероиду образоваться после инкубации. Полученные стероиды обладают высокой однородностью и могут быть собраны или культивированы в микролунках, в которых они были сформированы. Основное преимущество этого метода перед существующими методами заключается в том, что одновременно можно получать очень большое количество однородных агрегатов.

Люди, плохо знакомые с этим методом, могут обнаружить, что их топливо имеет очень большой размер. Важно убедиться, что суспензия ячеек равномерно распределена по пластине, а качающиеся держатели пластин в центральном фуге свободно перемещаются так, чтобы сила была перпендикулярна поверхности. Для начала приготовьте стерильную агролунку на 400 пластине, добавив в каждую лунку по 0,5 миллилитров поверхностно-активного вещества, содержащего промывочный раствор.

Использование поверхностно-активного вещества гарантирует, что клетки не будут взаимодействовать с поверхностью микролунки. Чтобы избежать попадания пузырьков воздуха в микролунки, добавьте жидкость с одной стороны и дайте ей распространиться по поверхности, а не капать вертикально на поверхность. После добавления раствора в лунки установите на место крышку.

Убедитесь, что ротор правильно сбалансирован, прежде чем центрифугировать пластины в течение двух минут 2000 раз G.To удалите пузырьки с помощью инвертированного микроскопа с малым увеличением, убедитесь, что пузырьки были удалены из микролунок. Выдерживайте тарелку не менее 30 минут при комнатной температуре или в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. Отсадите промывочный раствор из лунок и промойте пластину стерильной водой или PBS непосредственно перед использованием.

Не допускайте высыхания пластин после кодирования. Детали подготовки клеток будут варьироваться в зависимости от конкретного типа изучаемых клеток. Тем не менее, мы обнаружили, что это условие эффективно для широкого спектра клеток, включая линии, которые мы обсуждали здесь, а также эмбриональные стволовые клетки человека и нейронов, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека, фибробласты, предполагаемые, примитивные эндоны и стромальные клетки.

Отсадите питательную среду из колбы, и добавьте три миллилитра трипсина. Инкубируйте клетки в течение пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия. Остановите переваривание трипсина, добавив три миллилитра питательной среды.

Переложите остаток в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров. Затем из 15 миллилитровой пробирки возьмите аликвоту для подсчета клеток. Центрифугируйте клетки в течение пяти минут при 200-кратном перегрузке, пока идет центрифугирование.

Посчитайте клетки. Далее аспирируйте среднюю смесь триина и замените ее свежей порослью. Среда в объеме, определяемом требуемой плотностью ячеек, предварительно рассчитанной, как описано в текстовом протоколе, в качестве необязательного шага.

Пропустите клеточную суспензию через ситечко, чтобы удалить комки. Сфероиды могут быть получены в различных составах сред, однако первоначальные испытания должны быть проведены с использованием среды, в которой клетки были культивированы. Чтобы отличить последствия перехода к трехмерной системе культивирования от последствий изменения состава среды, начните с добавления 0,4 мл питательной среды в каждую луночную центрифугу на две минуты в 2000 раз G.To удалите пузырьки с помощью инвертированного микроскопа с малым увеличением, убедитесь, что пузырьки были удалены из микролунок.

Далее в микролунки добавляем 0,4 миллилитра клеточной суспензии при необходимой плотности. Затем аккуратно перемешайте пипетированием вверх и вниз, не вводя пузырьки воздуха в микролунки, следите за тем, чтобы ячейки равномерно распределились по всей лунке. Для получения стабильных стероидов.

Центрифугируйте планшет в течение пяти минут 200 раз. G, пластина должна быть сбалансирована как внутри, так и относительно другой пластины, чтобы вес равномерно распределялся по обеим сторонам держателя плит. Это гарантирует, что планшет самовыравнивается во время центрифугирования, так что конвекционные потоки не возникают и не приводят к неравномерному распределению ячеек по микролункам.

С помощью инвертированного микроскопа убедитесь, что клетки сгруппировались в микролунках и равномерно распределены по лунке, прежде чем инкубировать клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. Наблюдайте за процессом формирования сфероида с помощью инвертированного микроскопа. Некоторые клеточные линии образуют компактный стероид в течение 24 часов.

Другие могут занять больше времени. Здесь показана прогрессия от кластера к агрегату в ячейках HT 29. Самая сложная часть этой процедуры заключается в том, чтобы вывести стероиды интекс без нарушения структур. Чтобы извлечь стероиды из микролунок, очень осторожно пипетать вверх и вниз, чтобы сфероиды вышли из микролунок.

Затем наклоните пластину, чтобы аспирировать среднюю стероидную смесь. Используйте наконечники для пипеток с широкими отверстиями для стероидов большего размера, чтобы избежать разрушения стероида. После извлечения стероида из микролунок перенесите его в культуру суспензии, осторожно выведя их с помощью пипетки.

В качестве альтернативы, суровая роза может поддерживаться в припадке с помощью среднего замещения. Продолжительность зависит от исходного размера и скорости роста, которая определяет время, пока они не перерастут микролунки. Ну а они были созданы для замены среды без потери стероидов.

Отсасывайте среду по краю лунки. С помощью пастбищной пипетки медленно опускайте кончик вниз, пока он не начнет вытягивать жидкость из мениска, и следуйте за мениском вниз, когда он опускается. Затем добавьте свежую среду у стенки колодца там же.

При добавлении свежей среды не забывайте осторожно нажимать на пипетку и прижимать наконечник к стене, чтобы избежать нарушения PHE в микролунках. Некоторые стероиды могут быть потеряны. Однако, если средний всегда отсасывается и заменяется в одном и том же положении, это число останется небольшим.

По сравнению с большим количеством стероидов в лунке, стероиды из нескольких опухолевых линий различного анатомического происхождения могут быть легко экстрагированы в суспензию. Последовательный контроль размера, достижимый с помощью этого метода, продемонстрирован здесь с высокооднородными популяциями стероидов. При каждом условии образуется от 700 или 1 500 ячеек.

Явные интерлайн-различия в поведении также заметны у клеток рака толстой кишки HT 29 и клеток рака пищевода TE 6, образующих плотно упакованные стероиды с четко очерченными границами. И наоборот, клетки рака предстательной железы Лин Кап дают начало менее когерентным стероидам с неправильными границами. Более сильные внутренние силы в более когерентных агрегатах также приводили к коллапсу в более симметричную форму, даже находясь еще в микроямах, в которых они были сформированы.

Тем не менее, агрегаты lin cap, особенно при больших размерах, заметно сохраняют квадратную геометрию параметалла микролунок. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что пузырьки еще одного пузырька проходят через микролунки перед добавлением ячеек.