Количественная оценка респираторный взрыв ответ как показатель врожденной иммунной здравоохранения в данио рерио

Общая цель данной процедуры заключается в использовании флуоресценции для количественной оценки окислительного взрыва. Сначала поместите эмбрионы zebrafish в лунки 96-луночного планшета. Затем добавьте флуоресцентный субстрат и активируйте окислительный взрыв с помощью химического агента.

Затем количественно определите относительную флуоресценцию с помощью флуориметра. В конечном итоге интенсивность флуоресценции используется для оценки потенциала респираторного всплеска. Данный метод может быть применен для изучения влияния экспериментальных манипуляций на общее состояние врожденного иммунитета.

В данной работе мы используем этот метод для изучения респираторного взрыва у эмбрионов zebrafish, однако он также может быть применен к другим системам, таким как взрослые особи zebrafish, клетки почек и клеточные препараты других видов рыб. Выращивайте эмбрионы в глубоких чашках Петри при 28 °C в яичной воде до достижения нужной стадии развития. Ежедневно удаляйте погибшие эмбрионы.

Осторожно слейте старую яйцевую воду и ежедневно заменяйте ее новой. В день проведения эксперимента приготовьте разбавленный рабочий раствор флуоресцеина в микроцентрифужной пробирке объемом 1,7 мл, обернутой фольгой. Также приготовьте рабочий раствор PMA с конечной концентрацией 20 µg/mL.

Затем приготовьте по 5 мл каждого дозирующего раствора в конических пробирках объемом 15 мл, как описано в сопроводительном тексте. Держите дозирующие растворы на льду. Сначала включите микропланшетный ридер и прогрейте источник света для измерения флуоресценции. Настройте программу, указав длины волн возбуждения и эмиссии, положение оптики и чувствительность, а также добавьте этап встряхивания в течение 5 секунд.

Перед началом работы подготовьте необходимые для эксперимента материалы: чашки с покрытыми эмбрионами, черный 96-луночный микропланшет, дозатор P 200 с наконечниками, ведерко со льдом с реагентами, содержащими флуоресцеин, многоканальный дозатор P 200, два стерильных резервуара, алюминиевую фольгу и ножницы.

Теперь обрежьте наконечник пипетки так, чтобы эмбрионы или почки могли проходить через отверстие. Установите дозатор P 200 на 100 µL и перенесите один эмбрион вместе с яичной водой в нужное количество лунок черного 96-луночного микропланшета. Затем с помощью многоканального дозатора P 200 перенесите дозирующий раствор в стерильный резервуар объемом 25 mL.

Добавьте 100 µL дозирующего раствора H 2D CFDA в одну лунку 96-луночного микропланшета; повторите процедуру для половины контрольных образцов эмбрионов и половины экспериментально модифицированных образцов эмбрионов. Налейте дозирующий раствор, содержащий PMA, в новый стерильный резервуар объемом 25 mL.

Затем разлейте этот дозирующий раствор по остальным лункам 96-луночного микропланшета. Накройте микропланшет алюминиевой фольгой и поместите на шейкер примерно на 20 секунд. В периоды между считываниями инкубируйте микропланшет при температуре 28 °C и скорости перемешивания 150 RPM.

Считайте показания микропланшета после добавления PMA. Продолжайте проводить измерения каждые несколько минут в течение желаемого интервала времени или инкубируйте обернутый в фольгу микропланшет при 28 °C до определенного момента времени. Затем извлеките эмбрионы из лунок и проведите эвтаназию эмбрионов в соответствии с институциональным протоколом по уходу и использованию животных.

Кроме того, утилизируйте микропланшет и другие одноразовые материалы в контейнер для биоопасных отходов. Определите временную точку, в которой вы хотите сравнить флуоресценцию. Вычтите среднее значение флуоресценции неиндуцированной контрольной группы из индивидуальных значений флуоресценции контрольной группы, индуцированной PMA.

Повторите эти действия для экспериментальной группы с PMA и без него. Затем сохраните полученные значения нормированной флуоресценции в столбцы: группа контроля с PMA и экспериментальная группа с PMA. Далее рассчитайте средние значения и стандартные отклонения для показателей нормированной флуоресценции группы контроля с PMA и экспериментальной группы с PMA.

Сравните нормализованные значения флуоресценции с помощью непарного t-критерия для определения статистической значимости. Затем постройте график средних значений для контрольной группы с PMA и экспериментальной группы с PMA с планками погрешностей, отражающими соответствующие стандартные отклонения; укажите уровень значимости на графике и в подписи к рисунку. В данном эксперименте сравнивается ответ окислительного взрыва в эмбрионах zebrafish дикого типа линии AB через 48 и 72 часа после оплодотворения.

Сырая флуоресценция в группах, индуцированных PMA, измерялась через четыре часа после добавления PMA. Значения сырой флуоресценции были выше в популяции 72 HPF. Как следует из рассчитанных средних значений, показатели флуоресценции были нормализованы для учета вариабельности уровней фоновой флуоресценции.

Результаты этого анализа окислительного взрыва показали, что эмбрионы данио-рерио на стадии 72 HPF способны вырабатывать значительно больше активных форм кислорода и, следовательно, демонстрируют более выраженный окислительный взрыв после индукции PMA, чем эмбрионы на стадии 48 HPF. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как использовать флуоресценцию для количественной оценки потенциала окислительного взрыва эмбрионов данио-рерио. Не забывайте, что работа с порошком PMA может быть крайне опасной, поэтому соблюдайте меры предосторожности, например, используйте защитную маску при взвешивании порошка PMA.