Количественная оценка респираторный взрыв ответ как показатель врожденной иммунной здравоохранения в данио рерио

Общая цель этой процедуры заключается в использовании флуоресценции для количественной оценки реакции на взрыв дыхания. Сначала загрузите эмбрионы данио-рерио в лунки 96-луночной пластины. Затем добавьте флуоресцентный субстрат и активируйте дыхательный взрыв химическим средством.

Затем количественно оцените относительную флуоресценцию с помощью флуориметра. В конечном счете, флуоресценция используется для отображения потенциала дыхательного взрыва. Этот метод может быть использован для изучения того, как экспериментальные манипуляции влияют на общее врожденное иммунное здоровье.

Здесь мы используем его, чтобы получить представление о дыхательном взрыве у эмбрионов данио-рерио, но он также может быть применен к другим системам, таким как взрослые рыбки данио, клетки почек и клеточные препараты других видов рыб. Выращивайте эмбрионы в глубоких чашках Петри при температуре 28 градусов Цельсия в яичной воде до желаемой стадии развития. Ежедневно удаляйте все мертвые эмбрионы.

Тщательно сцеживайте старую яичную воду и ежедневно пополняйте ее новой яичной водой. В день эксперимента изготовьте восстановленный рабочий раствор флуоресцеина в обернутую фольгой микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 миллилитров. Также приготовьте рабочий раствор из расчета 20 микрограмм на миллилитр PMA конечной концентрации.

Затем вносят по пять миллилитров каждого дозирующего раствора в 15 миллилитровые конические пробирки, как описано в сопроводительном тексте. Держите дозирующие растворы на льду сначала включите устройство на считывателе микропланшетов и нагрейте источник света для измерения флуоресценции. Настройте программу с подробным описанием длин волн возбуждения и излучения, чувствительности оптики к положению, а также включите пятисекундный шаг встряхивания.

До начала камыша организуйте экспериментальные поставки блюд с покрытыми зародышами кожи. Черная 96-луночная микропластина, пипетка P 200 и опрокидывание ведра со льдом с реагентами, содержащими флуоресцеин. Многоканальная пипетка P 200, два стерильных резервуара, алюминиевая фольга и ножницы.

Теперь обрежьте кончик пипетки так, чтобы эмбрионы или почки могли пройти через отверстие. Установите дозатор P 200 на 100 микролитров и перенесите один эмбрион вместе с яичной водой в столько лунок черного 96-луночного микропланшета, сколько нужно. Теперь налейте дозирующий раствор в стерильный резервуар объемом 25 миллилитров с многоканальным пипетером Р 200.

Добавьте 100 микролитров дозирующего раствора H 2D CFDA в одну колонку из 96. Что ж, микропланшет повторить для половины контрольных образцов эмбрионов и половины экспериментально манипулированных образцов эмбрионов. Налейте дозирующий раствор PMA в новый стерильный резервуар объемом 25 миллилитров.

Затем распределите этот дозирующий раствор в оставшиеся колонки 96 луночного микропланшета. Накройте микропластину алюминиевой фольгой и поставьте на шейкер примерно на 20 секунд. При 150 об/мин инкубируйте микропланшет при температуре 28 градусов Цельсия, когда он не считывается.

Считайте микропланшет после добавления PMA. Продолжайте проводить измерения каждые несколько минут в течение желаемого интервала времени или инкубируйте микропланшет, обернутый фольгой, при температуре 28 градусов Цельсия до определенного момента времени. Затем извлеките эмбрионы из колодцев, усыпьте эмбрионы в соответствии с протоколом ухода за животными и их использования.

Кроме того, утилизируйте микропланшет и другие одноразовые материалы в маляре по биологически опасным отходам. Определитесь с моментом времени, в который вы хотели бы сравнить флуоресценцию. Вычтите среднее значение флуоресценции неиндуцированной контрольной группы из значений флуоресценции гриппа в отдельной контрольной группе, индуцированной PMA.

Повторите это для экспериментальной группы с PMA и без него. Затем сохраните эти нормализованные значения флуоресценции в столбцах: контрольная группа плюс PMA и экспериментальная группа плюс PMA. Затем рассчитайте средние значения и стандартные отклонения для нормализованных значений флуоресценции контрольной группы плюс PMA и экспериментальной группы плюс PMA.

Сравните нормализованные значения флуоресценции с использованием непарного Т-критерия для определения статистической значимости. Теперь построим график средних значений контрольной группы плюс PMA и экспериментальной группы плюс PMA с полосами погрешностей, отражающими соответствующие стандартные отклонения, зафиксируем уровень значимости на графике и в легенде рисунка. В этом эксперименте сравнивают реакцию на взрыв дыхания у эмбрионов данио-рерио дикого типа на фоне АВ через 48 часов и 72 часа после оплодотворения.

Первичную флуоресценцию измеряли через четыре часа после добавления ФМА в группах, индуцированных ПМА. Исходные значения флуоресценции были выше в популяции 72 HPF. Как показывают расчетные средние значения, значения флуоресценции нормализованы с учетом изменчивости фоновых уровней флуоресценции.

Результаты этого анализа показали, что 72 эмбриона данио-рерио HPF способны производить значительно больше активных форм кислорода и, следовательно, имеют более устойчивую реакцию на респираторный взрыв, чем 48 эмбрионов HPF после индукции PMA. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как использовать флуоресценцию для количественной оценки потенциала дыхательных взрывов эмбрионов рыбок данио. Не забывайте, что работа с порошком PMA может быть чрезвычайно опасной, поэтому используйте меры предосторожности, такие как ношение маски для лица во время взвешивания порошка PMA.