Polymalic кислота основе Nano Биополимеры для таргетинга из нескольких онкомаркеров: возможность для персонализированной медицины?

Общая цель заключается в создании наноразмерной платформы, открытой для универсального протокола синтеза персонализированных лекарственных препаратов на основе генетических особенностей заболевания конкретного человека, в частности при раке. Сначала синтезируют и очищают полималоновую кислоту из микроорганизма frum polycephalum, затем химически активируют очищенную PMLA по ее боковым карбоксильным группам. К этим группам путем замещения активированных групп присоединяют малые функциональные группы и линкер MEA, после чего неиспользованные активированные группы возвращают в форму карбоксильных групп путем гидролиза.

Затем добавьте антитела и антисмысловые молекулы через сульфгидрильные группы спейсера, MEA и кэпа. Неиспользованный спейсер после завершения реакции с PDP проверьте на состав и функциональность ведущего соединения. Результаты применения нанопрепарата получены на животной модели, например, на мышах с агрессивной формой заболевания человека.

Два положительных маркера HER при раке молочной железы позволяют определить эффективность лечения, а также отсутствие нежелательных побочных эффектов. Основным преимуществом биопроизводства по сравнению с существующими синтетическими методами, такими как открытая полимеризация, является то, что биополимер сохраняет полную оптическую чистоту и не загрязняется побочными продуктами. Это семейство нанопрепаратов PolyPhen может воздействовать на любой тип клеток на основе специфического таргетинга и регулировать экспрессию белков.

В целом, лечение рака с помощью нанопрепаратов на основе PHE очень эффективно на нескольких моделях животных, в частности при первичных раках головного мозга и молочной железы. Изначально эта идея возникла как метод блокирования синтеза специфического для глиобластомы ламинина в изоформах, а впоследствии мы доказали возможность таргетирования и ингибирования белков HER2 и тройного отрицательного рака молочной железы для предотвращения роста опухоли. Возможности данной методики распространяются и на диагностику рака с использованием оптической и магнитно-резонансной томографии.

Полимерные нанопрепараты позволяют глубже понять механизмы доставки лекарств для лечения рака. Они также могут быть применены при других патологических состояниях, таких как инфекционные заболевания, купирование боли и неврологические расстройства. После выращивания посевной культуры плазмодия из спирали на буре инокулируют 100 milliliters базовой питательной среды и культивируют её при температуре 25 degrees Celsius.

В термостате с регулируемой температурой под действием силы тяжести подготавливают плотную культуру микроплазмы в среде в отсутствие света. Чтобы избежать споруляции в биореакторе объемом 10 литров, растворите 80 граммов карбоната кальция в восьми литрах базовой среды, затем перенесите плотную культуру микроплазмы в установленный реакционный сосуд и запустите биопроцесс на 75 часов. Поддерживайте температуру 25 °C при потоке фильтрованного воздуха 10 литров в минуту и перемешивании сегментной мешалкой со скоростью 150 RPM.

Когда pH культуральной среды достигнет 4.8, остановите культивирование для измерения выхода полималеиновой кислоты. Теперь охладите среду до 17 °C, дайте клеткам осесть под действием силы тяжести и удалите супернатант культуры из реактора. Доведите pH до 7.5.

Теперь прокачайте супернатант снизу вверх через колонку с DEAE-целлюлозой объемом 1,5 литра, уравновешенную 20 мМ трис-гидрохлоридом (pH 7,5) при температуре 5 °C. Затем пропустите три колонных объема промывочного буфера, содержащего 0,3 М NaCl, снизу вверх по колонке; элюируйте PMLA в присутствии 0,7 М NaCl. Доведите концентрацию CaCl₂ в элюированной фракции PMLA до 0,1 М и добавьте 80% ледяного этанола для осаждения кальциевой соли PMLA; затем проведите фракционирование кальциевой соли PMLA с использованием Sephadex G-25 и воды.

В завершение пропустите каждую фракцию через колонку с янтарным сорбентом, немедленно заморозьте поток полималоновой кислоты в жидком азоте и подвергните лиофилизации перед хранением при температуре -20 °C. Для активации карбоксильных групп PMLA смешайте 1 ммоль малонных звеньев PMLA-H в 1 мл безводного ацетона и по 1 ммоль гидроксициннамовой кислоты и циклогексилкарбодиимида в 2 мл диметилформамида; после перемешивания при 20 °C в течение трех часов добавьте 0,05 ммоль метил-ПЭГамина в 1 мл DMF, а затем 0,05 ммоль триэтиламина.

Затем по каплям добавьте 0,4 ммоль этилового эфира лейцина, а через один час проверьте полноту протекания реакции с помощью тонкослойной хроматографии по отсутствию исходного вещества. Аналогичным образом добавьте 0,1 ммоль 2-меркаптоэтанола, 0,1 ммоль этиламина и 0,5 ммоль TEA. Удалите остатки NHS-эфира путем спонтанного гидролиза с использованием фосфатно-солевого буферного раствора.

Проведите обессоливание на колонке PD 10 и лиофилизируйте полученный продукт до получения белого порошка; храните этот преконъюгат в сухом виде при температуре -20 °C. Затем добавьте 30 mg антитела в 4,5 mL 150 mM NaCl в 100 mM натрий-фосфатном буфере при pH 5.5. Восстановите дисульфидные связи, используя 5 mM гидрохлорида трис(2-карбоксиэтил)фосфина, и очистите образец на колонке PD 10.

Теперь растворите IDE PEG IDE в двух миллилитрах вышеупомянутого буфера, но при pH 6.3. Добавьте восстановленные антитела и перемешивайте при 20 °C в течение одного часа. Концентрируйте до 2.5 мл с помощью AVEVA spin 20 с порогом отсечения 30 kDa, а затем очистите на колонке cidex G 75.

Теперь проверьте продукт с помощью SEC-HPLC. Измерьте количество при 280 нм, а также подтвердите отсутствие примесей на других длинах волн. Затем смешайте 50 мг предварительного конъюгата с 200 мкмоль антитела, конъюгированного с PEG-IDE, в пяти миллилитрах буфера с pH 6,3.

Доведите концентрацию сульфгидрильных групп до 2 mM и инкубируйте при 20 °C в течение трех часов. Для получения выхода 98% растворите антисмысловой олигонуклеотид с 3'-аминомодификацией, смешав его с одним объемом SPDP, очистите A-O-N-P-D-P с помощью Sephadex LH 20 в метаноле, затем выпарите метанол, растворите продукт в воде и лиофилизируйте. Теперь инкубируйте 800 nM активированных AO с антителом, предварительно конъюгированным с PEG-MEA SH, в течение ночи. По завершении реакции обмена дисульфидов введите блок флуоресцентного красителя, заблокируйте избыток сульфгидрильных групп с помощью PDP и очистите смесь с помощью Sephadex G 75.

Храните конечный нанопрепарат на основе полималеиновой кислоты при температуре -20 °C. Для определения содержания полималеиновой кислоты в процессе производства действуйте следующим образом: к 320 µL образца добавьте 160 µL 10% гидроксиламонохлорида и 160 µL 10% гидроксида натрия. Через 10–15 минут смешайте с 160 µL 5% раствора хлорида железа (III) и зафиксируйте появление темно-пурпурного окрашивания при 540 nm. Затем проведите гидролиз нанопрепарата в течение ночи в 2 M соляной кислоте при 110 °C в герметичной ампуле; определите содержание малеиновой кислоты методом обращенно-фазовой хроматографии.

Используйте образцы, в которые добавлены стандарты малеиновой кислоты. Теперь расщепите нанопрепарат с помощью 100 мМ дитиотреитола и измерьте количество морфолиновых антисмысловых олигонуклеотидов методом количественной обращенно-фазовой ВЭЖХ по сравнению со стандартами морфолиновых антисмысловых олигонуклеотидов. Используя расщепленный нанопрепарат, измерьте содержание антител с помощью набора для анализа белков, чтобы количественно определить содержание малеинового PEG.

Сначала проведите реакцию с тиоцианатом аммония, затем выполните экстракцию хлороформом и измерьте абсорбцию при 510 нанометрах. Проверьте активность антител и ко-лигацию с помощью ELISA, используя 5 µL нанопрепарата на лунку и 0,5 µg HER2 на лунку в качестве антигена для покрытия планшета. В завершение рассчитайте достигнутый процент для антисмыслового олигонуклеотида, EG и антитела по отношению к малеиновой кислоте.

Сравните с процентом, предусмотренным при разработке препарата. Этот бимодальный стратегический подход к нанопрепарату использует Herceptin для ингибирования сигнального пути HER2 и специфическую к HER2 олигонуклеотидную последовательность (ON) для блокирования транскрипции рецептора HER2; антитела облегчают трансцитоз через эндотелиальный TFR сосудов опухоли. Платформа наноконъюгата на основе полималеиновой кислоты была получена с помощью культуры micro plasmo и очищена; активация карбоксильных групп PMLA облегчила синтез каркаса преконъюгата.

И, наконец, ведущий наноконъюгат. Анализы Eli SA продемонстрировали сохранение активности моноклональных антител на протяжении всего процесса синтеза нанопрепарата. Поскольку оба антитела были собраны на одной полимерной платформе, с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии удалось отследить клеточный захват нанопрепарата.

Наложенные друг на друга изображения через ноль и три часа были проанализированы совместно с мечеными эндосомами. Коэффициенты корреляции Пирсона для колокализации указывают на высвобождение нанопрепарата из эндосом в цитоплазму и диссоциацию ON от нанопрепарата за счет глутатион-зависимого расщепления дисульфидных связей в цитоплазме. In vitro ведущий нанопрепарат наиболее эффективно и значимо подавлял рост в клеточной линии с гиперэкспрессией HER two.

Эксперименты in vivo на мышах с имплантированной линией клеток рака молочной железы человека BT 4 74 с гиперэкспрессией HER2 показали более чем 95% ингибирование роста при использовании ведущего нанопрепарата, содержащего Herceptin и HER2-специфический A ON. Вестерн-блоттинг ex vivo указал на ингибирование как синтеза HER2, так и фосфорилирования AKT; расщепление PARP свидетельствовало об апоптозе. Регрессия опухоли в ответ на терапию препаратом подтверждается уменьшением размеров опухоли и истощением популяции опухолевых клеток по данным гистологического исследования.

Теперь вы должны хорошо понимать, как использовать биосовместимую наноплатформу для обеспечения эффективного персонализированного лечения без побочных эффектов, а также как создавать нанопрепарат с контролируемым составом и подтвержденной функциональной активностью. После освоения метода данные сенсоры могут воспроизводиться с высокой точностью. Данный метод с использованием наноплатформы на основе полиакриловой кислоты для направленной доставки антисмысловых олигонуклеотидов открывает перед исследователями в области персонализированной наномедицины возможности для изучения лечения опухолей, нацеленного на специфические молекулярные маркеры опухоли, выявленные в ходе персонализированного генетического анализа. Фармакологически активные агенты и клетки могут быть чрезвычайно опасны.

При выполнении данной процедуры необходимо всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование маски и перчаток.