Микротехнологий нанопористого Шаблоны золото для сотового материала исследования взаимодействия

Общая цель этой процедуры заключается в изготовлении нанопористых микромоделей золота и демонстрации их совместимости с клеточной культурой. Это достигается путем создания сначала трафаретных или фотолитографических масок. Второй шаг заключается в совместном распылении золота и серебра через маски, чтобы смоделировать сплав-предшественник для нанопористого золота.

Затем образцы золотого и серебряного сплава легируются азотной кислотой для получения нанопористых золотых покрытий. Заключительным этапом является культивирование клеток по нанопористым микроузорам золота и их иммуноокрашивание, в конечном итоге флуоресцентная и сканирующая электронная микроскопия в сочетании с анализом изображений используются для количественной оценки взаимодействий клеточного материала. Основное преимущество этого метода по сравнению с другими методами создания наноструктурированных покрытий, таких как углеродные нанотрубки, заключается в том, что нанопористое золото выигрывает от совместимости с микропроизводством, высокой эффективной площади поверхности, простоты функционализации с химией на основе плитки, электропроводности и биосовместимости.

Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области материаловедения и биоинженерии, такие как влияние наноструктуры материала на электрические, механические, биологические и химические свойства. Тем не менее, этот метод дает представление о влиянии наноструктуры на морфологию клетки. Он также может быть применен к другим системам, таким как разработка биосенсоров, систем доставки лекарств и платформ хранения энергии.

Начните эту процедуру с очистки предметных стекол микроскопа размером один дюйм на три дюйма и маленьких защитных стекол раствором пираньи. Загрузите маленькие защитные стекла в фарфоровую лодку для иммуноокрашивания и погрузите лодочку и предметное стекло микроскопа в раствор пираньи. Подробнее о процедуре очистки см. в текстовом протоколе. После очистки переложите образцы в чашки для кристаллизации и промойте их водой в течение трех минут.

Поместите образцы на безворсовые полотенца и высушите их феном с помощью азотного пистолета, чтобы создать узоры в миллиметровом масштабе. Прокол листов силиконового эластомера толщиной 250 микрон с помощью пуансополии для биопсии. Очистите обработанные листы эластомера, погрузив их в 70% изопропанол, а затем высушите азотным пистолетом.

Затем положите перфорационный лист на безворсовое полотенце и совместите очищенные защитные листы по трафарету с поверхностью образца, обращенной к трафарету. Перенесите трафарет с защитными листами на несущую пластину, чтобы создать узоры субмиллиметрового масштаба. Поместите очищенный микроскоп, наденьте вращающийся патрон и сдуйте все частицы азотным пистолетом.

Вынесите 1,5 миллилитра гексаметилдилана на предметное стекло. С помощью пластиковой пипетки распределите гексаметилдилан, последовательно вращая предметное стекло со скоростью 500 об/мин в течение пяти секунд и 1500 об/мин в течение 30 секунд. Когда закончите, выпекайте горку на горячей плите при температуре 115 градусов Цельсия в течение семи минут, а затем дайте ей остыть в течение пяти минут.

Далее выдайте четыре миллилитра позитивной фотографии. Упирайтесь в предметное стекло. Разверните фоторезист, вращая слайд в условиях, описанных ранее.

Выпекайте горку на горячей плите при температуре 115 градусов Цельсия в течение 1,5 минут и снимите ее после воздействия ультрафиолета и выпечки. Растворите экспонированную фотографию. Сопротивляйтесь, погрузив слайд в позитивную фотографию.

Сопротивляйтесь проявлению не менее 3,5 минут. Когда закончите, тщательно промойте предметное стекло деионизированной водой и осмотрите разработанные узоры под оптическим микроскопом. Затем загрузите образцы в распылительную машину, которая может самостоятельно наносить золото, серебро и хром

Очистите образцы в течение 90 секунд при мощности 50 Вт в атмосфере обработки 25 миллиторр Аргонн, прежде чем начать осаждение металла при 10 миллиторр Аргоннском хроме в течение 10 минут при 300 Вт. Затем распыляйте золото в течение 90 секунд при мощности 400 Вт, а затем распыляйте золото и серебро в течение 10 минут с серебром на 200 Вт и золотом на 100 Вт. Выключите источник напыления золота примерно за 10 секунд до выключения источника напыления серебра.

Извлеките образцы из распылительной машины после извлечения образцов из распылительной машины. Обработайте их ультразвуком примерно в 180 миллилитрах позитивной фотографии. Resist stripper в течение 10 циклов 22-й ультразвука с двухминутными паузами между циклами.

Когда закончите, промойте образцы водой di и высушите их азотным пистолетом. Осмотрите металлические узоры под микроскопом. Затем отделите эластомерный трафарет от образцов, не покрытых фоторезистом, с помощью двух пинцетов, чтобы выявить осажденный металл.

Обработайте небольшие покровные стекла воздушной плазмой мощностью 10 Вт в течение 30 секунд перед погружением их в азотную кислоту. Десплавьте предметные стекла микроскопа, погрузив их в стакан с 70% азотной кислотой при температуре 55 градусов Цельсия на 15 минут. После того, как делегирование будет завершено, промойте образцы, последовательно погружая их в стаканы с водой три раза каждая.

Поместите образцы на безворсовые полотенца и высушите их феном с помощью азотного пистолета. Отрегулируйте температуру конфорки в диапазоне от 150 до 300 градусов по Цельсию. Затем медленно опустите образцы на горячую поверхность, чтобы свести к минимуму резкое изменение температуры.

Через пять минут снимите образцы с горячей плиты для остывания. Поместите образцы нанопористого золота в полистирольные чашки и обработайте их воздушной плазмой мощностью 10 Вт в течение 30 секунд. Затем перенесите образцы в 24 луночные планшеты для культивирования тканей.

Добавьте в каждую по 500 микролитров готовой питательной среды. Хорошо храните планшеты во влажном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 до посева клеток. Поддерживайте клетки мышиных астроцитов в колбах с Т 75 питательными средами.

Как только клетки слится на 70%, пропустите их, сначала удалив старую среду и промойте клетки PBS. Смотрите текстовый протокол для получения подробной информации об условиях passeng. После извлечения культуральных планшетов из инкубатора отсасывайте отработанные среды из лунок и затравливайте клетки на стекло.

Укрытие скользит плотностью 25 000 клеток на квадратный сантиметр при итоговом объеме в один миллилитр. Встряхните культуральную пластину, чтобы обеспечить равномерное покрытие клеток над образцами, и поместите культуральную пластину в инкубатор, когда клетки будут готовы к анализу. Извлеките отработанные среды из лунок и дважды промойте их PBS.

После того, как клетки зафиксированы в 4% параформальдегида в PBS и дважды промыты, замачите их в 500 микролитрах 0,1% Triton X 100 в PBS в течение пяти минут. Повторите промывку PBS два раза и переложите ячейки в чистые лунки. Промокните 80 микролитров раствора для окрашивания на образцы и храните их накрытыми алюминиевой фольгой в течение 20 минут.

После еще одной промывки PBS окрашивайте клетки тремя наномолярами DPI в PBS в течение пяти минут. Промойте элементы PBS еще раз и окуните их в ди, затем установите элементы на стекло. Накройте слайды монтажным материалом и заклейте их прозрачным изображением лака для ногтей.

Поверхность нанопористого золота с помощью сканирующего электронного микроскопа с увеличением 50 000 раз при энергии электронов 10 киловольт с использованием детектора вторичных электронов. После этого можно получить составные изображения клеток в разных местах образцов с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа с 10-кратным увеличением и соответствующими фильтрующими кубиками. Откройте изображения на изображении J.Разделите изображения на отдельные каналы.

Конвертируем их в восемь ставок. Вычитаем фон и сглаживаем их с помощью медианной фильтрации. Затем отрегулируйте порог вручную, чтобы выделить поры, тела клеток и ядра.

Используйте команду watershed для разделения объединенных пор или клеток. Задайте параметры анализа частиц и выполните команду для извлечения количества частиц, средней площади и процента покрытия частицами. Наконец, измените включенные файлы макросов для выполнения пакетного анализа нескольких изображений.

Здесь отображается изменение цвета наплавленных металлических узоров до и после d легирования. Серебристая отделка обусловлена содержанием богатого серебра сплава при легировании. Пленка приобретает заметный оранжево-коричневый оттенок.

Здесь показаны более тонкие особенности, полученные с помощью фотолитографии. Нанесение рисунка на металл. Различная плохая морфология может быть получена путем термической обработки нанопористых золотых пленок.

Изображение поперечного сечения показывает, равномерно ли легированы пленки по толщине пленки. Изображения, полученные с помощью сканирующего электронного микроскопа, могут быть сегментированы на двоичные изображения для определения размера и процента покрытия пустотами. Код для генерации этого вывода можно загрузить с веб-страницы JoVE.

Здесь представлено репрезентативное флуоресцентное изображение адгезивных клеток мышиных астроцитов, культивируемых на поверхности нанопористого золота. Отдельные каналы изображения могут быть разделены и сегментированы для получения двоичных изображений для анализа взаимодействия клеточного материала. Изображения сегментированного цитоскелета могут быть использованы для количественной оценки площади клеток и покрытия поверхности.

В то время как изображения сегментированных клеточных ядер полезны для подсчета клеток. Коды для генерации этих выходных данных можно загрузить с веб-страницы JoVE. Здесь показано визуальное резюме неудач при изготовлении нанопористых золотых структур, включая адгезию пленки PO, отсутствие пористости и чрезмерную термическую обработку.

После этой процедуры другие методы предполагают электрохимическую характеристику при лесной микроскопии, лизисе клеток, а также ПЦР для дальнейшего ответа на дополнительные вопросы, такие как влияние адгезии наноструктур клеток и экспрессия генов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как получать нанопоры из золота и количественно оценивать их взаимодействие с клетками с помощью цифрового анализа изображений микроскопии. Результаты. Не забывайте, что работа с азотной кислотой, серной кислотой и перекисью водорода может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, включая выращивание средств индивидуальной защиты.