Использование системы 3D-слежения Автоматизированная для записи отдельных и косяки взрослых данио рерио

Общая цель данной процедуры заключается в изучении трехмерных паттернов движения zebrafish или других водных животных, а также в анализе их кинематических, пространственных и социальных характеристик. Это позволяет выявлять изменения в поведении, вызванные генетическими мутациями, химическими или экологическими факторами. Для достижения этой цели сначала проводится калибровка системы, которая также корректирует значительные искажения изображения, возникающие вследствие рефракции.

Вторым этапом является одновременная запись видеокадров с относительно высоким временным разрешением как минимум с двух разных ракурсов. Затем программное обеспечение реконструирует траектории движения рыб. Применяются усовершенствованные алгоритмы для снижения уровня шума и определения положения рыбы в случаях окклюзии или кластеризации.

Заключительным этапом является анализ данных и проведение статистического анализа ускорения скорости, угла поворота, горизонтального и вертикального распределения в контейнере для наблюдения, межиндивидуальных расстояний и других интересующих параметров. В конечном счете, высокоскоростной калиброванный 3D-трекинг полезен для изучения поведенческих дефицитов у мутантных zebrafish и воздействия лекарственных препаратов на различные поведенческие системы. С точки зрения поиска новых лекарственных средств, одним из преимуществ данной системы является возможность изучения поведения рыб в 3D.

Это важно, поскольку рыбы естественным образом перемещаются в трех измерениях, и при одновременной записи нескольких особей 2D-регистрация может привести к ошибочным выводам при исследовании пространственной конфигурации группы. Еще одним преимуществом системы является коррекция рефракции света, которая в текущей конфигурации, если ее не учитывать, может привести к значительным ошибкам измерения. Контейнер для наблюдения с рыбами данио-рерио помещается в наблюдательную камеру.

Камера также содержит видеокамеру, зеркало, подвешенное под углом примерно 45 градусов над контейнером, и светодиодные осветительные панели. Перед началом записи откалибруйте систему, чтобы определить положение стенок контейнера и поверхности воды, а также масштабный коэффициент записываемых кадров; дополнительно скорректируйте погрешность, возникающую из-за преломления света при переходе из воды в воздух. После завершения калибровки следует провести тестовый запуск с использованием имитатора рыбы.

Повторную калибровку следует проводить в случае смещения положения зеркала или камеры, а также при возникновении проблем с трекингом. Для начала сеанса записи поместите в наблюдательную камеру контейнер для наблюдений, заполненный водой до отметок. Ножки контейнера должны быть вставлены в центрирующие отверстия.

Расположите контейнеры таким образом, чтобы полупрозрачные или непрозрачные стенки были обращены к дальней стороне и направо относительно камеры. Затем включите свет в отсеке, поместите рыбу в контейнер и закройте шторы. Откройте модуль записи, после чего на экране появятся изображения контейнера в виде спереди и сверху.

Первоначально полученное изображение может быть не идеальным, поэтому для достижения достаточного контраста между рыбой и фоном может потребоваться определенная настройка. Для настройки изображения выберите управление камерой (camera control), затем в открывшемся окне общих настроек снимите галочки с отмеченных здесь полей и отрегулируйте выдержку (shutter) и усиление (gain) так, чтобы изображение не было переэкспонированным. Далее в левой части окна управления камерой выберите баланс белого (white balance color), в новом окне снимите галочку с поля «авто» (auto) и отрегулируйте значения красного и синего цветов для достижения наилучшего цветового контраста как при виде спереди, так и при виде сверху.

После завершения калибровки может потребоваться ее повторная корректировка. В главном меню модуля записи выберите «Расположение данных» (data location), чтобы создать или выбрать папку. Для каждой записи должна быть создана отдельная папка, являющаяся подпапкой папки эксперимента.

Теперь нажмите «Начать запись» (start recording) и введите целое число, обозначающее продолжительность записи в минутах, затем нажмите «ОК», после чего начнется сеанс экспериментальной записи. По завершении записи скопируйте и вставьте подпапки с данными о контейнере животного и данными о соответствии из папки калибровки в папки, созданные ранее во время записи; чтобы начать реконструкцию пути, откройте модуль траекторий программного обеспечения. Затем нажмите «Расположение данных» (data location), чтобы выбрать папку, созданную с помощью модуля записи.

Затем нажмите кнопку настройки системы, чтобы сначала открыть окно параметров, и отрегулируйте пороги цвета для верхнего и нижнего видов. Хорошим начальным значением будет 1000. Далее выберите пороги размеров для верхнего и нижнего видов.

Для рыбки-зебры среднего размера подходящим начальным значением будет 10; для крупной рыбки используйте 20, а для маленькой — 5. Чем выше эти пороги, тем меньше вероятность того, что программное обеспечение зафиксирует шум. Однако при слишком высоком значении программа может не обнаружить рыбу.

В дальнейшем в ходе эксперимента может возникнуть необходимость в повторной корректировке этих пороговых значений. Для верхнего порога размера обычно достаточно значения 3000. Для специфической длины оставьте предустановленное значение 220.

Количество рыб (The number of fish) относится к числу рыб в смотровом резервуаре. Максимальное количество точек (Max numb of points) означает общее количество кадров; запишите или запомните это число и нажмите «ОК». Затем выберите «получить фон» (acquire background).

В следующем окне будет предложено заполнить два поля. После загрузки фонового изображения с помощью мыши отрегулируйте положение трех красных рамок; эти рамки обозначают области, в которых программное обеспечение будет искать рыб. Минимизируйте левую рамку.

Поскольку вид сбоку используется только для калибровки, теперь нажмите кнопку запуска генерации траекторий, и начнется реконструкция пути. В идеале метка должна быть размещена на изображении рыбы; если она часто располагается неправильно, откройте окно информации. Здесь представлен идеальный случай, когда видны только контуры рыбы.

В случае возникновения чрезмерного шума нажмите кнопку stop в главном меню и выберите новые пороговые значения цвета и размера. Также проверьте, можно ли немного уменьшить красные области. Например, в верхней части, чтобы исключить шум, вызванный движением воды, следите за траекторией на 3D-экране.

Щелкнув правой кнопкой мыши, исследователь может выбрать между вращением и перемещением 3D-конфигурации. Чтобы начать обработку данных, откройте модуль обработки данных, выберите «project» на панели инструментов, затем в выпадающем меню выберите «new» и введите название эксперимента. Далее выберите «edit project».

Затем добавьте в проект, после чего создайте новую группу и укажите название для экспериментальной группы. Теперь выберите экспериментальную группу в правом окне. Обратите внимание, что панель инструментов изменится.

Выберите «edit group» (редактировать группу), затем «add to group» (добавить в группу) и «new measurements» (новые измерения). После этого откроется окно браузера. Далее откройте папку, созданную во время записи, выберите подпапку «trajectories» (траектории), а затем файл сглаженных точек (point smoothened file).

В приведенном здесь примере для группы A было загружено шесть файлов, а для группы B — четыре файла. Чтобы начать анализ, выберите файл с функцией сглаживания точек в правом окне. Затем в выпадающем меню выберите «обработка данных» (data processing) и «конечные точки одного значения» (single value endpoints).

Для иллюстрации выберите заморозку по длительности (duration freezing). Откроется окно, в котором можно указать параметры заморозки с точки зрения порога скорости и порога длительности, чтобы ознакомиться с работой программы. Попробуйте другие примеры, такие как распределение глубины по пройденному расстоянию (travel distance depth distribution), которое позволяет определить количество уровней глубины и частоту серий импульсов.

При выборе этого варианта будет выполнена пакетная обработка с использованием стандартного порога, при которой в данном контексте будет рассчитано около 200 конечных точек. Значение «по умолчанию» означает, что разделители уже установлены. Например, в настоящее время распределение по глубине рассчитывается для трех уровней глубины, а угловое распределение — для четырех секторов.

После генерации параметров откроется новое окно с запросом пути сохранения и имени создаваемого файла. Данные будут сохранены в формате CSV и могут быть импортированы в другое программное обеспечение. Здесь на рисунке A показан типичный пример кадра для контроля.

Рыбки-зебра, в то время как на рисунке B показан типичный пример кадра для рыбок-зебра, подвергнутых воздействию MK 801; оба видео были записаны в ходе утренней сессии. Заметьте, что контрольные рыбки-зебра находились близко к дну и держались плотной группой. Напротив, рыбки-зебра, получавшие MK 801, находились ближе к поверхности и плавали на значительном расстоянии друг от друга.

Здесь представлены две репрезентативные траектории для контрольных особей данио-рерио и рыб, обработанных 10 µM MK 801, для утренней и дневной сессий. На данном рисунке представлены средние социальные дистанции для контрольной группы и рыб, обработанных 10 µM MK 801, для обеих сессий, а также временные шкалы средних межиндивидуальных расстояний для обеих групп.

На рисунке А представлено распределение данио-рерио по 10 равным уровням глубины во время утренней сессии, а на рисунке B — распределение во время дневной сессии. Здесь показано временное распределение экспериментальных групп по четырем радиальным зонам. На врезке указано расположение этих зон от центра к периферии; далее представлено временное распределение экспериментальных групп по четырем квадрантам.

На врезке показано расположение квадрантов. Двойные линии обозначают белые стенки, одинарные линии — прозрачные стенки. Камера расположена слева от врезки, то есть ближе всего к первому и четвертому квадрантам.

Черные звездочки обозначают сравнения между группами утренней сессии, а серые звездочки — между группами дневных сессий. Наконец, здесь представлены компоненты X, Y, Z пройденного расстояния для zebrafish во время утренних и дневных сессий. Представлены среднее значение и стандартная ошибка среднего.

При работе с системой помните, что качество данных напрямую зависит от качества записи, поэтому убедитесь, что система правильно откалибрована, а настройки камеры оптимальны. В остальном всё просто, и достаточно лишь ознакомиться с последовательностью действий.