Быстрое Протокол по подготовке Электрокомпетентные Кишечная палочка И Холерный вибрион

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы быстро и удобно создать компетентные бактерии в один и тот же день. Они нужны для трансформации. Это достигается путем предварительного нанесения бактерий на LB-агар и их инкубации в течение четырех-шести часов.

Далее бактериальный газон тщательно собирают с поверхности агара, а гранулу повторно суспендируют в стерильной холодной воде или буфере. Затем бактериальную гранулу трижды промывают при четырех градусах Цельсия и ресуспендируют в 40 микролитрах. Наконец, компетентные клетки подвергаются электропорации в присутствии ДНК.

В конечном итоге можно получить результаты, которые показывают уровни бактериальной трансформации, сравнимые с теми, которые были получены при использовании традиционного метода, требующего значительного оборудования, больших объемов бактериальных культур и стерильных буферов. Основное преимущество этого метода перед существующими методами заключается в том, что свежие, компетентные бактерии могут быть приготовлены практически из любого лабораторного штамма в тот же день, когда запланировано превращение, без необходимости использования больших центрифуг, роторов или лидеров стерильных буферов и культур. Создатель этого протокола не может быть идентифицирован, поскольку он использовался и оптимизировался многочисленными исследователями на протяжении долгого времени.

Представленный здесь метод используется в наших лабораториях в течение почти двух десятилетий, и наша цель — поделиться этим полезным протоколом с нашими коллегами. Наглядная демонстрация этого метода важна для одного шага. В частности, сбор бактерий с газона на шнеке, потому что требуется опытный глаз, чтобы оценить рост на пластине.

И это лучше всего визуализируется. Процедуру демонстрирует г-жа Тереза Брукс, научный сотрудник лаборатории доктора Те Коски в Университете Альберты в Эдмонтоне, Канада. Чтобы начать подготовку бактериальной культуры ближе к вечеру, используйте небольшое количество кишечной палочки или V-корейка для инокуляции от одного до пяти миллилитров автоклавного бульона LB в стерильные пробирки из босиликатного стекла.

Поместите инокулированные пробирки в роликовый барабан и инкубируйте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и высокой скорости. Приготовьте разбрасыватель ячеек в форме хоккейной клюшки из стеклянного стержня, нагрев середину стержня в пламени горелки Бунзена до тех пор, пока стекло не станет мягким. Затем с помощью пинцета или плоскогубцев аккуратно направьте изгиб под углом 135 градусов.

Нагрейте стержень еще раз в средней точке между концом и первым изгибом и согните его под углом 45 градусов внутрь. Приготовьте легкие аэраторы с антибиотиками и без них и храните при температуре четыре градуса Цельсия. На следующее утро.

Нанесите 100 микролитров культуры на ночь на каждую пластину с агаром LB. С помощью распределителя клеток инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение четырех-шести часов или до тех пор, пока не станет видна тонкая лужайка для роста бактерий. С помощью инокуляционной петли соберите бактериальную массу диаметром около двух миллиметров с пластины и суспензируйте ее в одном миллилитре ледяного воздуха.

Два миллимоляра хлорида кальция. Если вы используете v coray или стерильную дважды дистиллированную воду для кишечной палочки с помощью охлаждаемой центрифуги, установленной на четыре градуса Цельсия, вращайте суспензию в течение пяти минут при 5000 G. Выбросьте надосадочную жидкость и повторите промывку еще два раза. После снятия окончательной надосадочной жидкости суспензируйте гранулу в 40 микролитрах хлорида кальция или дважды дистиллированной воды и держите на льду.

Чтобы провести трансформацию, добавьте до одного микрограмма плазменной ДНК в 40 микролитров бактериальной суспензии, и перенесите смесь в предварительно охлажденный стерильный зазор 0,2 сантиметра. Вете, вставляем его в камеру электропорации модуля импульсного контроля и питаем при напряжении 1,8 киловольта и 25 микрофазах. Постоянная времени должна составлять около 5,0 миллисекунд, и дуги не должно возникать.

Быстро ресуспендируйте клетки в одном миллилитре LB бульона и переложите в предварительно автоклавную стеклянную пробирку для жарки. Дайте клеткам восстановиться путем инкубации в условиях аэрированного роста при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут без выбора антибиотика. Поместите бактерии на планшеты LB ager с антибиотиком и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи.

Как показано здесь, мы провели ряд преобразований с помощью ecoli и V-co-матрицы, чтобы сравнить эффективность трансформации нашей быстрой методологии с адаптацией традиционного метода, первоначально описанного Doer et al. для получения электрокомпетентных бактерий. Выход трансформанта находился в пределах от 10 из шестого до 10 из седьмого КОЕ на микрограмм ДНК в трех повторных экспериментах для e. coli и v coray. Использование традиционного метода для электрокомпетентности.

В трех реплицитных экспериментах для e. coli и v coray с использованием экспресс-метода выход клеток, выход трансформанта снизился в десять раз до 10, в пятый, до 10 до шестого КОЕ. По этой причине мы определили процент трансформированных бактерий путем деления трансформированных КОЕ на количество КОЕ, восстановленных в результате фиктивных превращений из идентичных партий компетентных клеток. Процент трансформированных бактерий находился в пределах одного логарифма.

Независимо от способа приготовления и вида преображаемого. Эти результаты свидетельствуют о том, что эффективность быстрого метода сопоставима с эффективностью традиционной, более длительной процедуры получения компетентных клеток, и что репрезентативные штаммы ieo, coray и esia coli в равной степени поддаются быстрой процедуре. Как только вы освоите эту технику, ее можно выполнить в течение пяти-шести часов, если она будет выполнена должным образом.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о сборе бактерий во время логарифмической фазы их роста, промывке их в стерильном, свежеприготовленном и предварительно охлажденном буферном водном растворе и хранении в холоде до тех пор, пока они не будут повторно суспендированы в LB после электропорации. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как быстро генерировать электрокомпетентные специфические клетки бактериального штамма в вашей лаборатории, культивируя их на первом газоне, собирая их во время логарифмической фазы роста, а затем промывая их в холодном буфере для подготовки к электропорации.