Визуализация Эффекты положительного ранний опыт, тактильная стимуляция, на дендритных морфологии и синаптические связи с Гольджи-Кокса Окрашивание

Общая цель этой процедуры заключается в использовании методов окрашивания золотом по Г. Коксу для визуализации морфологических изменений в нейронах, которые следуют за тактильной стимуляцией в раннем возрасте. Это достигается путем введения тактильной стимуляции три раза в день с третьего дня после рождения до 21-го дня после рождения. Второй шаг заключается в перфузии животных, как только они достигнут возраста исследования, и хранении их мозга в растворе Goldy cos.

Затем мозги нарезаются с помощью Аомэ. Заключительным этапом является пропитка мозга с помощью техники окрашивания GOGI co. В конечном счете, процедура GOGI co используется для визуализации отдельных нейронов, что позволяет анализировать морфологические изменения.

Прелесть метода Гоя Кокса заключается в том, что он позволяет нам количественно оценить структуру нейронов и соотнести ее с поведенческими результатами. Применение этой техники распространяется на нарушения развития, поскольку было показано, что тактильная стимуляция эффективна как в поведенческом, так и в анатомическом восстановлении после этих нарушений. Хотя этот метод может дать представление о нейроанатомии крыс, он также может быть применен к другим модельным организмам и тканям мозга человека.

Чтобы помочь нам углубить наше понимание переживаемой зависимой пластичности, животные содержатся в 12-часовом темном цикле со свободным доступом к пище и воде после рождения. Каждая самка крысы содержится индивидуально со своим потомством. Чтобы избежать дополнительного стресса, связанного с обращением, щенки получают тактильную стимуляцию, начиная с P 3.

После взвешивания щенков перед утренним сеансом тактильной стимуляции перевезите щенков в домашних клетках в отдельную комнату для тестирования. Поместите домашнюю клетку на грелку, которая установлена на 24 градуса Цельсия. Когда вы будете готовы к тактильной стимуляции, удалите самок из их домашней клетки и поместите их во временную клетку с едой и водой.

Держите мать и временный садк в помещении для разведения. Далее с помощью жесткой доски разделите домашнюю клетку на две половины. Затем случайным образом распределите половину щенков из каждого помета для прохождения тактильной стимуляции, а другая половина будет служить контролем.

Отметьте их задние лапы и хвост перманентным маркером, чтобы разграничить группы, и поместите щенков в группу тактильной стимуляции с одной стороны клетки, а контрольных щенков — с другой. Установите таймер на 15 минут с помощью мягкого пера, похожего на тряпку. Расчесывайте всех щенков в группе тактильной стимуляции одновременно в течение 15 минут подряд.

Молодые крысиные детеныши обычно сбиваются в кучу и, кажется, входят в цикл глубокого сна, что позволяет очень легко стимулировать всех детенышей одновременно. По мере взросления щенки становятся более активными, некоторые щенки ходят и исследуют. Во время сеанса переместите всех бродячих щенков в группу, чтобы убедиться, что каждый щенок получает одинаковую стимуляцию.

После 15 минут тактильной стимуляции верните мать в клетку и перевезите клетку обратно в помещение для размножения. Этот процесс повторяется трижды в день. В течение 19 дней после заключительного сеанса тактильной стимуляции щенки отлучаются от матерей Щенки размещаются в клетках с пятью или шестью другими отлученными от груди животными того же пола, оставляют крыс в покое в стандартных условиях содержания до тех пор, пока они не достигнут возраста исследования.

Образцы собираются, когда животные достигают 100-дневного возраста. После эвтаназии и внутрисердечной перфузии мозг извлекается. Заботьтесь о том, чтобы мозжечок оставался неповрежденным.

Поместите мозги в непрозрачную бутылку Nalgene, наполненную 20 миллилитрами раствора Голди Кокса, где они будут храниться в течение 14 дней. Через 14 дней замените раствор 30%-ным раствором сахарозы. Подержите мозги в растворе сахарозы от двух до пяти дней перед срезом.

Промокните мозг насухо перед фиксацией на стадии секции акриловым клеем Сано, чтобы предотвратить разрыв или неравномерное сечение, убедитесь, что весь мозг надежно прикреплен к сцене. Затем заполните резервуар Vibram 6% раствором сахарозы до тех пор, пока он не покроет режущее лезвие. Установите скорость и амплитуду вибрама на пять.

Разрежьте мозг на срезы размером 200 микрон и поместите срезы на предметное стекло микроскопа размером 2% желатинизированный. Убедитесь, что срезы остаются влажными во время среза, когда все интересующие вас срезы будут собраны. Прижмите срезы к предметным стеклам, надавливая влажной бумагой.

Поместите предметные стекла в решетку для слайдов и храните их в камере влажности не менее 12 часов, но не дольше четырех дней. Чтобы начать процедуру окрашивания, промаркируйте и подготовьте 12 стеклянных тарелок для окрашивания. Сначала погрузите горки в дистиллированную воду на одну минуту.

Далее поместите предметные стекла в гидроксид аммония и подержите их в темноте в течение 30 минут. После дополнительной минуты в дистиллированной воде поместите горки в Kodak Fix на 30 минут с защитой от света. Поместите предметные стекла в дистиллированную воду еще раз перед обезвоживанием в нескольких растворах для градуированного спирта.

После последнего промывания спиртом поместите горки в раствор на одну треть на 15 минут. Наконец, поместите предметные стекла в hemo D на 15 минут. Когда все будет готово, используйте первостепенное средство, чтобы разместить защитные стекла на предметных стеклах и дайте им высохнуть на воздухе, прежде чем рассматривать их под микроскопом.

Вот репрезентативная фотография окрашенного параметаллического нейрона Гольджи Кокса у крысы, который получал тактильную стимуляцию во время развития. Увеличенная фотография показывает дендритные шипы на терминальных дендритах. Более светлое изображение слева — от крысы в контрольной группе, а более темное изображение — от крысы, которая получала тактильную стимуляцию.

На этом графике представлена средняя апикальная и базлерная дендритная сложность нейронов в третьей области CG у взрослых крыс, которые либо получали тактильную стимуляцию во время развития, либо не получали ее. Следуя этой процедуре, мы получаем преимущество: если мы хотим задать дополнительные вопросы, мы окрашиваем весь мозг, и поэтому мы можем вернуться и использовать ту же мозговую ткань, чтобы ответить на эти вопросы. Разработав эти методы, мы проложили путь для исследователей к изучению полезности тактильной стимуляции в качестве терапии для лечения травмы головы или других форм неврологических повреждений после ее развития.

Этот метод проложил путь исследователям в области нейробиологии к изучению его потенциала в восстановлении травм головного мозга и нарушений развития. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как предоставить щенкам обогащающий опыт тактильной стимуляции, а также средства для визуализации отдельных нейронов и синапсов.