Визуализация Эффекты положительного ранний опыт, тактильная стимуляция, на дендритных морфологии и синаптические связи с Гольджи-Кокса Окрашивание

Общая цель данной процедуры заключается в использовании метода окрашивания золотом по Коксу для визуализации морфологических изменений в нейронах, возникающих вследствие тактильной стимуляции в раннем возрасте. Для этого сначала проводят тактильную стимуляцию три раза в день с третьего по 21-й день после рождения. На втором этапе, по достижении животными искомого возраста, проводят перфузию и фиксируют мозг в растворе Голдюкоса.

Затем мозг нарезают с помощью Aome. Заключительным этапом является импрегнация мозга с использованием метода совместного окрашивания GOGI. В конечном счете процедура GOGI используется для визуализации отдельных нейронов, что позволяет анализировать морфологические изменения.

Преимущество метода Гой-Кокса заключается в том, что он позволяет количественно оценить структуру нейронов и соотнести ее с поведенческими результатами. Значимость данной методики распространяется на изучение нарушений развития, поскольку тактильная стимуляция доказала свою эффективность как в поведенческом, так и в анатомическом восстановлении при таких расстройствах. Хотя этот метод позволяет получить представление о нейроанатомии крыс, он также может быть применен к другим модельным организмам и тканям головного мозга человека.

Для более глубокого изучения пластичности, зависящей от опыта, животных после рождения содержат при 12-часовом цикле свет/темнота со свободным доступом к пище и воде. Каждую самку крысы содержат индивидуально с ее потомством. Чтобы избежать дополнительного стресса, связанного с манипуляциями, крысята получают тактильную стимуляцию, начиная с P3.

После взвешивания щенков перед утренним сеансом тактильной стимуляции перенесите их в домашних клетках в отдельное помещение для тестирования. Поместите домашнюю клетку на нагревательную подушку, установленную на 24 °C. Когда наступит время тактильной стимуляции, извлеките матерей из домашних клеток и поместите их во временную клетку с кормом и водой.

Оставьте самку и временную клетку в помещении для разведения. Затем с помощью жесткой перегородки разделите домашнюю клетку на две половины. После этого случайным образом распределите половину щенков из каждого помета в группу тактильной стимуляции, в то время как вторая половина будет служить контрольной группой.

Отметьте задние лапы и хвосты щенков перманентным маркером, чтобы дифференцировать группы, и разместите щенков из группы тактильной стимуляции в одной части клетки, а контрольных щенков — в другой. Установите таймер на 15 минут и, используя мягкую щетку-метелку, в течение 15 минут непрерывно массируйте всех щенков из группы тактильной стимуляции одновременно.

Молодые крысята обычно прижимаются друг к другу и, по всей видимости, впадают в фазу глубокого сна, что позволяет легко стимулировать всех детенышей одновременно. По мере роста крысята становятся более активными, некоторые начинают ходить и исследовать окружающую среду. В ходе сеанса перемещайте любого отбившегося крысенка обратно в группу, чтобы каждый детеныш получал равную стимуляцию.

После 15 минут тактильной стимуляции верните мать в клетку и перенесите клетку обратно в помещение для разведения. Эту процедуру повторяют три раза в день. В течение 19 дней после последнего сеанса тактильной стимуляции отнимите детенышей от матерей. Детенышей содержат в клетках по пять или шесть отнятых животных того же пола; крыс оставляют в стандартных условиях содержания без вмешательства до достижения возраста исследования.

Образцы собирают, когда животные достигают возраста 100 дней. После эвтаназии и интракардиальной перфузии извлекают мозг, стараясь сохранить мозжечок в целости.

Поместите головной мозг в непрозрачный флакон Nalgene, заполненный 20 миллилитрами раствора Голди-Кокса, где образцы должны находиться в течение 14 дней. По истечении 14 дней замените раствор на 30% раствор сахарозы. Выдержите головной мозг в растворе сахарозы от двух до пяти дней перед тем, как приступить к секционированию.

Промокните мозг насухо перед фиксацией на предметном столике для среза с помощью акрилового клея Sano, чтобы предотвратить разрывы или неравномерное срезание; убедитесь, что весь мозг надежно закреплен на столике. Затем наполните резервуар вибротома раствором 6% sucrose до тех пор, пока он не покроет лезвие для срезания. Установите скорость и амплитуду вибротома на значение пять.

Разрежьте мозг на срезы толщиной 200 микрон и поместите их на предметное стекло с 2% желатином. Следите за тем, чтобы срезы оставались влажными в процессе нарезки, пока не будут собраны все интересующие вас части. Плотно прижмите срезы к стеклам, используя увлажненную фильтровальную бумагу.

Поместите стекла в кассету и выдержите их в камере влажности не менее 12 часов, но не более четырех суток. Перед началом процедуры окрашивания промаркируйте и подготовьте 12 стеклянных кювет для окрашивания. Сначала погрузите стекла в дистиллированную воду на одну минуту.

Затем поместите предметные стекла в раствор гидроксида аммония и выдержите их в темноте в течение 30 минут. После дополнительного промывания в дистиллированной воде в течение одной минуты поместите стекла в раствор Kodak Fix на 30 минут, обеспечив защиту от света. Еще раз промойте стекла в дистиллированной воде перед обезвоживанием в серии растворов спирта возрастающей концентрации.

После последнего промывания спиртом поместите стекла в раствор One-Third на 15 минут. В завершение поместите стекла в Hemo D на 15 минут. Затем с помощью препарата Paramount накройте стекла покровными стеклами и дайте им высохнуть на воздухе перед исследованием под микроскопом.

Представлена репрезентативная фотография параметального нейрона крысы, подвергавшейся тактильной стимуляции в период развития, окрашенного методом Гольджи-Кокса. На увеличенном снимке видны дендритные шипики на терминальных дендритах. Более светлое изображение слева получено от крысы из контрольной группы, а более темное — от крысы, получавшей тактильную стимуляцию.

На данном графике представлена средняя сложность апикальных и базалярных дендритов нейронов в области CG3 взрослых крыс, которые либо подвергались тактильной стимуляции в период развития, либо нет. Следуя этой процедуре, мы получаем преимущество: при необходимости ответить на дополнительные вопросы мы можем вернуться к той же ткани мозга, так как был окрашен весь мозг. Разрабатывая данные методы, мы открыли исследователям путь к изучению эффективности тактильной стимуляции в качестве терапии для лечения травм головы или других форм неврологических повреждений после их возникновения.

Этот метод открыл перед исследователями в области нейронаук возможности изучения его потенциала для лечения травм головного мозга и нарушений развития. После просмотра этого видео вы должны будете хорошо понимать, как обеспечить щенков обогащающим опытом тактильной стимуляции, а также оспособах визуализации отдельных нейронов и синапсов.