Быстрый Micro-ионтофорезом глутамата и ГАМК: полезный инструмент по расследованию Synaptic интеграции

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы понять интеграцию входов вдоль очень сложной структуры нейронного дендритного дерева, что в конечном итоге приводит к нейронному выходу потенциалов действия в аксоне. Это достигается путем предварительного вытягивания соответствующих ионных апоретических пипеток. Вторым шагом является тестирование ионно-апоретических пипеток и правильная компенсация их емкости.

Затем установите конфигурацию всей ячейки. Последний шаг состоит в том, чтобы приблизиться к дендриту и вызвать постсинаптические потенциалы в записанной клетке. В конечном счете, быстрый микроионофорез позволяет исследовать интеграцию нескольких входов, которые также могут принадлежать различным нейротрансмиттерным системам.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, например, как интегрируются тормозные и возбуждающие входы и при каких условиях. Это может привести к нейронному выходу. Начните эту процедуру с вытягивания пипеток с очень маленькими наконечниками для контролируемого ионофореза нейромедиатора.

С помощью горизонтального или вертикального съемника для дозатора можно получить небольшие тонкие кончики за несколько этапов вытягивания. Тем не менее, наконечник все еще должен быть достаточно жестким, чтобы проникнуть в ткани. Затем настройте ионно-апоретический усилитель для проверки производительности пипетки в камере без ткани.

Наполните пипетку нейромедиатором и раствором, содержащим краситель. Затем поместите его в спинномозговую жидкость. Впоследствии компенсируют емкость с помощью усилителя.

Обычно очень острые пипетки будут иметь более высокую емкость, чем тупые, после правильной компенсации их емкости. Проверьте сопротивление пипетки с помощью встроенной функции усилителя микроионофореза. Пипетка должна иметь сопротивление от 25 до 90 мегаом.

После этого сосредоточьтесь на наконечнике пипетки с объективом погружения в воду с углом погружения в воду 60 или 40 раз. Затем переключитесь на флуоресцентную визуализацию. Если флуоресцентный D вытекает из наконечника пипетки, подайте небольшой положительный удерживающий ток в случае глутамата или отрицательный удерживающий ток в случае ГАМК.

Если это не помогает устранить утечку, замените пипетку. Затем подайте сильный шаговый ток на пипетку или используйте ручной триггер Следите за флуоресцентным изображением наконечника пипетки, чтобы увидеть, можно ли выбрасывать раствор. Если видимой утечки нет и пробный выброс прошел успешно, проверьте компенсацию емкости и начните эксперимент.

В целом, ионно-апоретные события могут быть вызваны в определенных местах в зависимости от желаемого эксперимента. Например, на колючем дендрите для глутаматного микрофореза или на дендритном стволе, соме или начальном сегменте аксона для микрофореза ГАМК. После определения конфигурации всей ячейки поместите наконечник ионной апоретической пипетки на расстоянии примерно одного микрометра от дендрита или другого интересующего сегмента.

Убедитесь, что нейромедиатор не утекает, а пипетка и емкость компенсированы правильно. Если приближение к клетке с помощью ионно-апоретической пипетки, наполненной глутаматом, вызывает обнаруживаемую деполяризацию мембраны, потенциальный глутамат вытекает из пипетки. Попробуйте отрегулировать ток удержания или заменить ионную апоретическую пипетку.

Затем подайте короткие отрицательные импульсы на ионно-апоретическую пипетку для получения тока глутамата, начиная с нуля, и систематически увеличивайте ток. Это помогает выяснить диапазон, в котором ионно-апоретический ток вызывает желаемые отклики в конкретной экспериментальной установке. Если реакция не обнаруживается, поднимите ионно-апоретический пипетку на несколько сотен микрометров и подайте сильный ток силой более 0,1 микроампера для очистки наконечника.

Затем отрегулируйте компенсацию емкости. Снова подойдите к клетке и повторите попытку. Если реакции по-прежнему нет, попробуйте уменьшить остаточный ток.

Тем не менее, будьте очень осторожны с уменьшением удерживаемого тока, так как это может привести к неконтролируемому высвобождению нейромедиаторов. Поэтому постоянно контролируйте запись, чтобы обнаруживать соответствующие изменения мембранного потенциала. Если глутамат вытекает из пипетки, откажитесь от пипетки для микроионофореза ГАМК.

Наполните новую пипетку раствором ГАМК. Очень важно иметь правильную полярность тока выброса при смене трансмиттера в пипетке. Для выброса ГАМК измените настройки на нормальные, что приведет к положительному току выброса для более легкого обнаружения ГАМКергических событий.

Впрыскивание длинных ступеней тока, приводящее к изменению потенциала мембраны от примерно отрицательных 100 милливольт до отрицательных 48 милливольт. С помощью этого протокола движущая сила ионов хлора может быть увеличена, что делает события более заметными, и выявляется равновесие события. На этом схематическом рисунке показан одиночный глутаматный микроионофорез.

Показанный здесь EPSP вызывается в однопирамидальном нейроне CA с ионофорезом глутамата, а изображенный здесь дендритный кальциевый спайк натрия вызывается в дендрите однопирамидального нейрона CA. Нижняя кривая показывает наклон кривой напряжения, а пик указывает на пиковый наклон дендритного спайка. При увеличении тока, подаваемого на ионофорный пипетку, амплитуда EPSP увеличивается до тех пор, пока не превысит порог потенциала действия.

На схематическом рисунке показан двойной глутаматный микроионофорез в разных местах дендритного дерева. Этот ионретический EPSP вызывается в проксимальном дендри одного пирамидального нейрона CA, а этот — в дистальном дите. На этом схематическом рисунке показан микрофорез ГАМК.

Показанный здесь ретикетный IPSP вызывается на проксимальном дендрите одного пирамидального нейрона CA, и инжекция длинного тока с различными амплитудами, приложенная к CA одному пирамидальному нейрону через патч-пипетку, помогает определить реверсивный потенциал вызванного события: вызванное событие обращается на противоположное при приблизительно отрицательном напряжении 70 милливольт. Наконец, на этом схематическом рисунке показан одновременный ионофорез глутамата и ГАМК, который исследует интеграцию возбуждения и торможения. Дендритные шипы вызваны только ретикическим применением глутамата.

В последующих развертках показаны здесь. Пики нижней кривой, показывающие наклон кривой напряжения, указывают на возникновение дендритных всплесков, и здесь имеется только ионно вызванный ГАМКергический IPSP. Наконец, вызываются как глутаматергические, так и ГАМКергические события вместе, что приводит к ингибированию дендритных спайков.

После просмотра этого видео вам должно быть очень легко установить быстрое микрорезиссуру в вашей лаборатории и получить представление о том, как синаптические входы интегрированы в нейроны.