Вскрытие и боковая навеска из эмбрионов данио рерио: Анализ спинномозговой развития шнура
28 февраля 2014 г.
С развитием процессы, такие как пролиферация, структурирование, дифференциации и аксонов может быть легко смоделированы в данио спинного мозга. В этой статье мы опишем монтажный порядок эмбрионов рыбок данио, которая оптимизирует визуализацию этих событий.
Общая цель данной процедуры заключается в препарировании и монтировании эмбрионов zebrafish для оптимальной микроскопической визуализации спинного мозга. Это достигается путем предварительного микродиссекирования и удаления хориона. На втором этапе удаляются остатки хориона, после чего эмбрионы переносят пипеткой на предметное стекло.
Затем излишки жидкости осторожно удаляют с помощью салфетки Kim, после чего добавляют среду для заключения препарата. На заключительном этапе с помощью специального зонда для эмбрионов (embryo poker) эмбрионы ориентируют на предметном стекле, затем накрывают их покровным стеклом. В конечном итоге для визуализации распределения тел постмитотических клеток и траектории растущих аксонов используют флуоресцентную или светлопольную микроскопию.
Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, такие как механизмы, ответственные за паттернирование, дифференцировку и наведение аксонов. Хотя данный метод дает представление о многих аспектах развития нервной системы, его также можно применять к другим тканям, например, к развивающейся мышечной ткани. Как правило, специалисты, впервые использующие этот метод, могут столкнуться с трудностями, так как перед началом эксперимента требуется проведение диссекции под микроскопом.
Изготовьте инструмент для манипуляций с эмбрионами, приклеив наконечник пипетки к стержню старой пипетки, а затем прикрепив к наконечнику леску. Для начала диссекции эмбрионов поместите до 30 эмбрионов данио-рерио в возрасте 24 часов после оплодотворения в чашку Петри диаметром 35 мм, наполненную PBS.
Под бинокулярным микроскопом зафиксируйте голову эмбриона пинцетом, осторожно отодвигая желток энтомологической иглой. Затем с помощью зонда для эмбрионов переместите их в ту часть чашки Петри, где меньше всего остатков желтка. После этого аспирируйте эмбрионов в стеклянную пастеровскую пипетку, забирая как можно меньше жидкости.
Затем осторожно перенесите пипеткой до 21 эмбриона на предметное стекло. Аккуратно удалите излишки жидкости с помощью лабораторной салфетки, стараясь не касаться эмбрионов, и добавьте на них одну каплю среды для заключения.
Теперь нанесите небольшое количество вазелина на каждый угол покровного стекла. Переверните покровное стекло стороной с вазелином вниз и поместите его поверх эмбрионов. Вазелин предотвращает повреждение эмбрионов вследствие избыточного сжатия.
Аккуратно постучите по углам покровного стекла, если это необходимо, пока среда для заключения не коснется стекла, используя дозатор в диапазоне от 20 до 100 µL. Добавьте больше среды для заключения рядом с покровным стеклом и дайте ей впитаться под него. Затем с помощью лабораторной салфетки полностью очистите область вокруг покровного стекла.
Не оказывайте давление на покровное стекло, так как это может повредить эмбрионы; после тщательной очистки область должна быть сухой, без остатков вазелина или mounting media. Завершите процедуру, запечатав края покровного стекла лаком для ногтей. После монтирования эмбрионов zebrafish были визуализированы несколько сегментов HEMI над расширением сердечного мешка.
На этом рисунке показана экспрессия NK X 6.1 в вентральной части спинного мозга эмбриона данио-рерио. мРНК NK X 6.1 распределена примерно в вентральной половине спинного мозга через 24 часа после оплодотворения. В домене прогениторов клетки-предшественники отличимы от постмитотических клеток по наличию ромбовидной пластинки, которая располагается в медиальной части спинного мозга.
Визуализация с использованием дифференциально-интерференционного контраста (DIC). Отдельные клетки четко различимы, и видна определенная граница между экспрессирующими и неэкспрессирующими клетками. Выход клеток-предшественников из клеточного цикла сопровождается изменениями в экспрессии генов.
На этом изображении показана экспрессия robo three в постмитотических нейронах. Рецепторы семейства robo являются рецепторами наведения аксонов, экспрессия которых позволяет точно подсчитать количество постмитотических нейронов. Обратите внимание, что на данной более латеральной фокальной плоскости не видны This floor plate и зона прогениторов.
Для визуализации иммунофлуоресценции znp one была использована конфокальная микроскопия; данный маркер окрашивает мотонейронные аксоны, что показано на этом эмбрионе в латеральной проекции. Мотонейроны выходят из спинного мозга в вентральном направлении через 24 часа после оплодотворения для иннервации окружающей развивающейся мускулатуры. При должном уровне навыка выполнение этой процедуры занимает 30 минут.
При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости сохранения целостности тканей путем тщательной микродиссекции. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как использовать методы микродиссекции для удаления желтка из эмбрионов zebrafish с целью их последующего монтирования и микроскопической визуализации.
Обзор
В данной статье представлен подробный протокол препарирования и монтирования эмбрионов zebrafish для оптимизации визуализации развития спинного мозга. Данный метод позволяет более эффективно изучать ключевые нейробиологические процессы, такие как наведение аксонов и дифференцировка.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология развития
- Методы микроскопии
Теоретические основы
- Эмбрионы данио-рерио представляют большую ценность для моделирования процессов развития.
- Понимание развития спинного мозга имеет решающее значение для нейробиологических исследований.
- Методы микроскопической визуализации необходимы для изучения клеточной динамики.
- Методы диссекции и монтажа требуют точности для сохранения целостности тканей.
Цель исследования
- Обеспечить надежный метод закрепления эмбрионов zebrafish.
- Облегчить визуализацию тел постмитотических клеток и траекторий аксонов.
- Углубить понимание механизмов, участвующих в нейроразвитии.
Используемые методы
- Микродиссекция эмбрионов zebrafish для удаления желтка.
- Монтирование эмбрионов на предметные стекла с использованием соответствующей среды.
- Использование инструмента для позиционирования эмбрионов (embryo poker) для ориентации при монтировании.
- Применение флуоресцентной и светлопольной микроскопии для визуализации.
Основные результаты
- Успешная визуализация экспрессии NKX6.1 в спинном мозге.
- Четкое различие между клетками-предшественниками и постмитотическими клетками.
- Демонстрация наведения аксонов посредством анализа экспрессии robo3.
- Эффективная визуализация моторных аксонов с помощью конфокальной микроскопии.
Выводы
- Описанный метод обеспечивает эффективное и качественное монтирование эмбрионов.
- Он позволяет глубже изучить развитие спинного мозга и нейробиологию.
- Освоение данной техники может значительно улучшить результаты исследований.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данный метод обеспечивает высокоточную визуализацию развития спинного мозга zebrafish, что способствует механистическим исследованиям наведения аксонов и дифференцировки нейронов. Благодаря удалению таких оптических барьеров, как желток и ткань сомитов, он повышает воспроизводимость рабочих процессов валидации нейробиологических мишеней. Этот подход представляет собой масштабируемую стандартизированную платформу для фенотипического скрининга на ранних этапах поиска, снижая уровень биологического шума при попытках механистического снижения рисков.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, связанные с паттернированием спинного мозга и механизмами наведения аксонов.
- Практическая ценность: сохраняет трехмерную архитектуру ткани для обеспечения согласованности дорсо-вентрального и антеро-постериорного анализа.
- Прогностическая ценность: способствует функциональной валидации мишеней путем визуализации тел постмитотических клеток и траекторий аксонов в системах, релевантных для изучаемого заболевания.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные данные о пространственном распределении экспрессии белков (например, NKX6.1, ROBO3) для стандартизации анализа.
- Практическая ценность: облегчает подготовку большого количества синхронизированных эмбрионов для высокопродуктивного скрининга.
- Готовность анализа: обеспечивает надежную оценку соединений благодаря сохранности тканей сомитов и четкой микроскопической визуализации процессов нейроразвития.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает связь между фундаментальными исследованиями и доклинической работой, предоставляя систему, релевантную конкретному заболеванию, для анализа механизмов нейроразвития.
- Механистическое снижение рисков: уменьшает неопределенность при выяснении сигнальных путей за счет прямой визуализации популяций клеток-предшественников и постмитотических популяций.
- Прогностическая достоверность: поддерживает принятие обоснованных решений о переходе к следующим этапам исследований с учетом рисков, обеспечивая стабильную и воспроизводимую визуализацию маркеров дифференцировки и наведения аксонов.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум ранних этапов поиска, обеспечивая проверку гипотез и снижение биологических рисков перед стадиями идентификации ведущих соединений и доклинической валидации.
- Биология открытий: способствует выяснению механизмов сигнальных путей и функциональной валидации нейроонтогенетических мишеней посредством прямой визуализации тканей.
- Скрининг: обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость анализа за счет использования унифицированных протоколов монтажа и ориентации эмбрионов.
- Аналитика: позволяет получать количественные данные флуоресцентной и светлопольной микроскопии для сравнительного анализа экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинических работ за счет сохранения целостности тканей для лонгитюдного отслеживания нейроразвития.
- Корпоративное повторное использование: создает воспроизводимую платформу для нейробиологического скрининга множества мишеней и экспериментальных парадигм.
Влияние на операционную деятельность и предприятие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности в исследованиях развития спинного мозга.
- Практическая ценность: Повышает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость нейробиологических анализов на базе zebrafish.
- Стратегическая ценность: Улучшает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и снижает биологические риски на поздних стадиях за счет раннего снижения механистических рисков.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию мишеней нейроразвития с учетом рисков на основе воспроизводимых фенотипических данных высокого разрешения.
Особенности реализации
- Требуются навыки микродиссекции и микроскопии для сохранения целостности тканей при удалении желтка.
- Зависимость от точности инструментов, включая диссекционные микроскопы, иглы для эмбрионов (embryo pokers) и средства контролируемого пипетирования.
- Необходима межгрупповая стандартизация среды для монтажа, протоколов ориентации и параметров визуализации.
- При адаптации следует учитывать вариабельность размера желтка и толщины тканей в зависимости от стадии развития модельной системы.
- Практические ограничения включают период обучения микродиссекции под микроскопом, особенно для начинающих пользователей.
