Количественный Анализ сотового мигрантах мышиных кишечных нейронных прародителей

Общая цель этой процедуры заключается в количественной оценке миграционного потенциала энтеральных нейропредшественников в присутствии различных факторов роста. Это достигается путем препарирования эмбрионального, тонкого кишечника мыши, населенного флуоресцентными клетками нейрокорки. Второй шаг – с помощью вибрирующего микротома сделать срезы кишечника толщиной 200 микрон.

Затем эти срезы инкубируются поверх коллагенового геля, содержащего факторы роста. Последним шагом является снятие срезов, чтобы обнажить мигрирующие клетки под ними. В конечном счете, флуоресцентная микроскопия используется для того, чтобы показать характер мигрирующих клеток внутри коллагенового геля.

Этот метод может помочь ответить на ключевой вопрос биологии развития, например, обеспечить лучшее понимание взаимодействия между различными сигнальными путями, лежащими в основе формирования периферической нервной системы. Через 12 дней после обнаружения вагинальной пробки усыпите самку мыши и удалите матку, поместив матку в стеклянную чашку Петри, наполненную льдом. Холодный PBS разрезает матку поперечно между отдельными деумными набуханиями, чтобы изолировать каждое место имплантации эмбриона под препарирующим микроскопом, с помощью тонких щипцов удаляют мышечный слой матки.

Откройте мешок с желтком и амнионом, чтобы показать эмбрион. Будьте осторожны при разрезании кровеносных сосудов, соединяя эмбрион с желточным мешком, поскольку они переплетаются с развивающимся кишечником. Затем введите закрытые щипцы в брюшную полость чуть выше печени темно-красного цвета и дайте им открыться.

При этом создается поперечное отверстие в брюшной полости. Потяните открытые щипцы вниз к заднему концу эмбриона, чтобы полностью открыть брюшную полость. Открыв, возьмитесь за соединительную ткань за печенью и вытащите кишки.

Соблюдая осторожность, чтобы не сломать кишечник. Разрежьте толстую кишку в любом месте, чтобы освободить кишки от остальной части эмбриона. Хвостовую часть оставьте на потом.

Вытащите соединительную ткань из слепой кишки, а затем кишечник, работая осторожно, чтобы не повредить их на ростральном конце тонкой кишки. Отрежьте печень и желудок, а также мезо, нефрос и генитальные гребни, если таковые имеются. Наконец, изолируйте тонкую кишку, отрезав слепую кишку и толстую кишку, а также оставшуюся соединительную ткань.

Как и раньше, следите за тем, чтобы не повредить кишечник. Перед внедрением оставьте тонкую кишку в PBS при комнатной температуре на как можно более короткое время. После отделения зародыша на шее запишите количество сомитов хвоста, чтобы точно определить стадию эмбрионального развития.

Прежде чем приступать к вскрытию эмбрионов, растопите 1,5 грамма агроса в 100 миллилитрах PBS и держите при температуре 50 градусов Цельсия. Подготовьте форму для встраивания, разрезав двухмиллилитровую микроцентрифужную трубку вдоль, чтобы вырезать примерно одну четверть стенки трубки. Вылейте растопленный агрос в форму и дайте ему остыть, пока он не станет слегка теплым на ощупь.

Когда все будет готово, возьмите кишку щипцами за сложенный ростральный конец и очень медленно протяните его через агрос, по длине формы. Это помогает держать кишечник прямо, в то время как агронаборы высвобождают ткань, как только она начинает сопротивляться движению, и отслеживать ориентацию кишечника рострального цесарки. Далее поместите форму в холодильник на две-три минуты для полного схватывания.

После застывания извлеките агрос из формы и обрежьте лишние агро с обоих концов, делая надрезы перпендикулярно кишечнику. Приклейте ростральный конец агроблока к металлической сцене микротома и обрежьте излишки ароса со всех сторон. Далее установите металлический столик на вибрационную камеру микротома.

При необходимости отрегулируйте угол наклона этапа, чтобы кишечник был максимально вертикальным. Накройте образец ледяным PBS, прежде чем опустить микротоновое лезвие на несколько миллиметров ниже буферной поверхности. Когда все будет готово, сделайте поперечные надрезы 200 мкм на самой тонкой кишке.

Следим за тем, чтобы каждый сельскохозяйственный срез содержал полноценный кишечный отдел. Аккуратно выложите свеженарезанные ломтики на заранее подготовленный коллагеновый гель. Поместив по одному ломтику ближе к середине каждой лунки, чтобы обеспечить миграцию клеток нейрогребня из баклажанов, инкубируйте ломтики в течение трех дней.

По истечении этого времени аккуратно снимите срезы коллагенового геля щипцами, стараясь не повредить гель ниже. Чтобы не нарушить схему миграции клеток, важно избегать непосредственного прикосновения к коллагеновому гелю во время последующих этапов инкубации и промывки. Сначала зафиксируйте клетки 500 микролитрами 4%-ной PFA на лунку в течение одного часа при комнатной температуре.

Далее замените фиксатор на 500 микролитров раствора DPI на лунку и выдержите 10 минут. При комнатной температуре тщательно удалите раствор DPI и промойте каждую лунку три раза 500 микролитрами PBS в течение пяти минут. Наконец, сфотографируйте флуоресцентные клетки, встроенные в коллагеновый гель в каждой лунке.

В этом примере факторы роста были использованы для стимуляции миграции GFP, экспрессирующих клетки кишечной нейрокоры. Пунктирная линия обозначает приблизительный размер и расположение эксплана. До того, как он был удален из геля, было обнаружено, что количество и распространение клеток, экспрессирующих GFP, мигрирующих из кишечного эксплана, было значительно выше в условиях лечения по сравнению с нелеченными.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как определить миграционный потенциал кишечных нервных предшественников путем инкубации кишечных срезов над коллагеновым гелем, содержащим факторы роста.