Обнаружение соматических генетических изменений в опухолевых образцов экзоном улавливания и Massively Parallel Секвенирование

Общая цель этой процедуры заключается в выявлении соматических мутаций в ассоциированных с раком генах клеток опухолевой ткани с использованием мультиплексных библиотек ДНК со штрих-кодом с последующим массовым параллельным секвенированием. Это достигается путем первого лигирования адаптеров секвенирования со штрих-кодом к фрагментам ДНК, выделенным из сохранившихся опухолей. Вторым этапом процедуры является гибридизация с биотинилированными олигонуклеотидами, комплементарными всем экзонам белковой оболочки 279 онкогенов и генам-супрессорам опухолей.

Третий шаг заключается в выполнении массово-параллельного секвенирования пулов со штрихкодами из захваченных библиотек. Последним шагом является поиск данных последовательностей на предмет связанных с раком изменений для 279 целевых генов. Эта процедура может выявить мутации последовательности, небольшие вставки, небольшие делеции, изменения числа копий и отдельные структурные изменения.

Таким образом, основные преимущества этого метода перед существующими методами заключаются в том, что он позволяет исследовать целые экзоны как на общие, так и на редкие мутации, а также выявлять дополнительные геномные изменения, такие как потери и прирост числа копий, и достигать большей чувствительности в гетерогенных образцах. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области геномики рака, такие как каковы ключевые движущие мутации при различных типах рака, и коррелируют ли эти мутации в клинических образцах с исходами или ответом на таргетную терапию? Применение этого метода распространяется на диагностику и лечение рака, поскольку мутации могут быть идентифицированы проспективно и использованы для помощи пациентам в выборе подходящей терапии и клинических испытаний.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этап пчелиной очистки трудно освоить из-за осторожной техники, необходимой при промывке и ускользании ДНК от гранул. Смешайте соответствующие объемы, чтобы получилось 50 микролитров на пробу. Распределите 50 микролитров каждой чистой ДНК в отдельные лунки шестилуночного планшета с внутренним диаметром.

Затем добавьте по 50 микролитров приготовленной концевой мастер-смеси в каждую реакцию и инкубируйте пластину в термоамплификаторе в течение 30 минут при температуре 20 градусов Цельсия для очистки реакции. Сначала добавьте 200 микролитров шариков AMP pure XP в каждый образец и аккуратно пипетируйте весь объем вверх и вниз 10 раз с помощью многоканального дозатора. После этого инкубируйте тарелку при комнатной температуре в течение 15 минут.

Далее переместите пластины на магнитную подставку и дайте им очиститься в течение 15 минут при комнатной температуре. После очистки аккуратно удалите и выбросьте большую часть надосадочной жидкости, стараясь не потревожить бусины. В колодцах может остаться некоторое количество жидкости.

Затем аккуратно добавьте 200 микролитров свежеприготовленного 80%-ного этанола в каждый образец и инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение 30 секунд. Осторожно удалите этанол пипеткой и повторите промывку еще раз. Далее дайте тарелке высохнуть при комнатной температуре, пока весь алкоголь не уйдет.

Теперь суспендируйте высушенные бусины в 44,5 микролитрах стерильной воды. Осторожно пропустите каждый образец через пипетку 10 раз с последним выбросом. Промойте все шарики, прикрепленные к стенке колодца.

Теперь выдержите в воде подвешенные шарики при комнатной температуре в течение двух минут, а затем переместите их на магнитную подставку на пять минут, пока лунки не станут чистыми. Наконец, аккуратно перенесите 42 микролитра прозрачной надосадочной жидкости в каждую лунку, содержащую образец, в новую лунку. Теперь образцы могут храниться при температуре минус 20 градусов по Цельсию до недели.

Начните с приготовления основной смеси для хвостов D в стерильной микроцентрифужной пробирке. Добавьте восемь микролитров приготовленной хвостовой мастер-смеси DA в каждую лунку с восстановленной ДНК. Затем инкубируйте пластину в термоамплификаторе в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы очистить реакцию.

Используйте тот же процесс, описанный в предыдущем разделе, в удвоенном объеме и завершите процедуру Resus, суспензив бусины в 33,75 микролитре стерильной воды. На этом этапе образцы могут храниться при температуре минус 20 градусов Цельсия до недели. Для продолжения готовят мастер-смесь для лигирования по 15 микролитров на реакцию.

Добавьте 15 микролитров мастер-смеси для лигирования в каждую лунку, содержащую ДНК D-хвоста. Далее добавляем 1,25 микролитра из соответствующих 25 микромоляров. Далее гибкий адаптер со штрих-кодом.

К каждому, ну и каждому образцу должен прилагаться отдельный переходник со штрих-кодом. Как только адаптеры будут загружены, инкубируйте планшет в течение 15 минут при температуре 20 градусов Цельсия. Теперь, используя 50 микролитров гранул, проведите зачистку после перевязки адаптера и повторно суспендируйте образец в стерильной воде до 50 микролитров.

Затем проведите процесс очистки во второй раз, закончив 23 микролитрами воды. На этом этапе образцы могут храниться при температуре минус 20 градусов Цельсия до недели. Следующим шагом является библиотечная амплификация каждого образца, которая подробно описана в текстовом протоколе по таянию льда, универсальным и индексным блокаторам олигонуклеотидов, библиотеке CCAP easy и компонентам Nimble Gen Capture, которые включают в себя буфер для гибридизации con TNA two X и компонент гибридизации.

О. Теперь приготовьте пул индексных олигонуклеотидных блокаторов в один миллимоляр, соответствующий специфическим последовательностям адаптеров со штрих-кодом, используемым при подготовке библиотеки. Соедините по одному микролитру каждого блокатора и перемешайте их вместе в течение 10 секунд В новой пробирке объемом 1,5 миллилитра приготовьте смесь для захвата, состоящую из пяти микролитров конте А в конте А в контекте А в контекте из расчета один миллиграмм на миллилитр, двух микролитров универсального блокатора и двух микролитров блокатора пула. Объедините 24 библиотеки штрих-кодов в одну реакцию.

Добавьте в общей сложности от одного до трех микрограммов объединенной библиотеки последовательностей со штрихкодами в микс захвата. Проделайте от 15 до 20 отверстий в колпачке с помощью иглы калибра или меньше и всасьте смесь в вакуумном концентраторе A DNA при температуре 60 градусов Цельсия до полного высыхания. Далее регидратируйте смесь в буфере для гибридизации и гибридизационном компоненте А. Закройте отверстия в колпачке скотчем и переведите образец на 10 секунд.

Затем центрифугируйте смесь на максимальной скорости в течение 10 секунд. Теперь кратко инкубируйте смесь при температуре 95 градусов по Цельсию, чтобы денатурировать ДНК. После этого следует 10-секундное центрифугирование на максимальной скорости при комнатной температуре в 0,2-миллилитровой полосковой пробирке для ПЦР, смешайте 2,25 микролитра зондов ccap easy library capture с тем же объемом стерильной воды, не содержащей нуклеаз.

Затем на центрифуге реакцию перемешайте в пробирку и аккуратно пропустите весь объем через наконечник пипетки 10 раз. Теперь инкубируйте 0,2 миллилитровую пробирку в термоамплитере при температуре 47 градусов Цельсия в течение 48-96 часов. Поддерживайте температуру крышки термоамплификатора на уровне 57 градусов Цельсия, чтобы предотвратить испарение и стабилизировать температуру реакции через несколько дней.

Используйте шаги для промывки и восстановления захваченной ДНК. Затем используйте модифицированный протокол Roche nimble gen для амплификации захваченной ДНК путем количественного определения амплифицированной захваченной ДНК с помощью высокочувствительного анализа кубитов. Один пул из 24 библиотек последовательностей со штрих-кодами, который содержал 12 нормальных пар опухолей, был захвачен с помощью зондов 279 раковых генов и секвенирован как два по 75.

Считывание пар оснований на одной полосе опухоли проточных клеток HighSeq 2000 и нормальных библиотек было объединено в соотношении два к одному. Изображение IGV показывает специфичность покрытия последовательности в экзонах EGFR при раке легкого, серые полосы представляют уникальные чтения последовательностей. Гетерозиготная мутация T 2 G справа присутствовала в 24% прочтений, что указывает на то, что это соматическая аминокислотная замена L 8 58 R.

Ни одно из прочтений нормальной легочной ткани не показало этой мутации TTA G, некоторые инделы в опухоли колоректального рака, нормальная пара показала соматическую вставку со сдвигом рамки считывания в ПК или соматическую делецию семи пар оснований. В TP 53 также наблюдались изменения числа копий между нормальными парами опухоли. Каждая точка данных представляет собой один экзон из 279 генов-мишеней.

Прирост и потеря числа копий определяются по увеличению и уменьшению охвата опухолевой последовательности После освоения этот метод может быть выполнен за шесть с половиной часов для подготовки библиотеки совместного использования и от 48 до 96 часов для гибридизации захвата, если она выполнена правильно. Хотя выполнение этого анализа чрезвычайно важно, необходимо быть осторожным с загрязнениями во время подготовки библиотеки, так как это может затруднить анализ данных. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как подготовить библиотеки ДНК со штрих-кодами и выполнить захват Exxon на этих объединенных библиотеках.