Обнаружение, Визуализация и количественного генерации активных форм кислорода в модельной системе Amoeba

Общая цель данного эксперимента заключается в том, чтобы предоставить простое и универсальное решение для мониторинга различных активных форм кислорода или АФК и их локализации, а также обеспечить дальнейшее понимание клеточных механизмов, связанных с АФК. Это достигается путем проведения трех различных анализов, в первом из которых используются шарики с зеленым покрытием RST или OB G и живая микроскопия, флуоресцеин ob g и Alexa. Fluor 594 ковалентно связаны с поверхностью трехмикронных шариков сика с помощью BSA.

Флуоресцентное излучение флуоресцеина OBG указывает на окисление АФК, в то время как сигнал от Alexa Fluor 594 помогает локализовать шарики и служит в качестве контроля для количественного определения флуоресценции. Во втором методе используется сверхоксидно-чувствительный зонд дигидроэтидий или DHE в анализе на основе планшетного ридера. В результате окисления супероксидом этидий способен интеркалировать в ядерную и митохондриальную ДНК и имеет смещенные пики возбуждения и излучения на 522 нм и 605 нм соответственно.

Интенсивность флуоресценции AUM соответствует количеству продукции супероксида, что позволяет количественно измерить внутриклеточную генерацию супероксида в клетках. Третий метод также основан на анализе с помощью планшетного ридера. Чувствительный к перекиси водорода зонд plex ultra red или UR используется для количественного измерения производства внеклеточной перекиси водорода.

Интенсивность флуоресценции UR OX соответствует количеству перекиси водорода, производимой вне клеток. Получены результаты, свидетельствующие о локализации динамической генерации АФК на основе анализов O-B-G-D-H-E и UR. Основное преимущество этого метода по сравнению с другими существующими методами, такими как OB GSA на основе пластинчатой скорости, заключается в том, что он динамически визуализирует генерацию Al Roth на уровне одной ячейки.

Вместо зеркального и усредненного сигнала Рота от популяции клеток. Такие методы усреднения популяций имеют тенденцию скрывать важную информацию из-за несинхронного фагоцитоза. Чтобы начать процедуру кодирования бусин оксихом, Burt Green или OBG, добавьте в пробирку объемом 1,5 миллилитра один миллилитр суспензии карбоксилированных гранул кремнезема размером 3,0 мкм.

Раскрутите трубку, чтобы быстро удалить надосадочную жидкость. Добавьте один миллилитр PBS и таким образом вортекс. Вымойте бусины три раза с помощью PBS.

После третьей стирки удалите надосадочную жидкость и снова подвесьте бусины. В одном миллилитре PBS, содержащем 25 миллиграммов на миллилитр цианида, раствор цианида необходимо каждый раз готовить свежим перед использованием, выдерживать на колесе в течение 15 минут. Это активирует гранулы карбоксилированного диоксида кремния, чтобы ковалентно связывать предварительно помеченный BSA через 15 минут, центрифугировать пробирку, удалять надосадочную жидкость.

Добавьте один миллилитр буфера для соединения и трижды промойте его с помощью буфера для соединения путем быстрого отжима и вортексинга, чтобы удалить излишки цианида, смешайте промытые шарики с 500 микролитрами буфера для соединения, содержащими один миллиграмм OBGH двух H-F-F-B-S-A, а затем заполните трубку газообразным азотом из стандартного газового баллончика. После укупорки тюбика, инкубированного на колесе в течение 14 часов при комнатной температуре в темноте, на следующий день погасите нереактивный OBG, дважды промыв шарики одним миллилитром буфера для гашения путем быстрого отжима и вортексирования, затем дважды промойте соединительным буфером, чтобы удалить буфер для гашения. После удаления надосадочной жидкости добавьте один миллилитр связующего буфера, содержащего 50 мкг LOR 594 цин среднего эфира для конъюгирования с BSA.

Заполните пробирку азотным колпачком и выдерживайте на колесе 1,5 часа при комнатной температуре в темноте. По окончании 1,5-часовой инкубации остановите реакцию, трижды промыв бусины одним миллилитром закалочного буфера. Далее следует трехкратная промывка бусин одним миллилитром PBS.

Наконец, Луч суспензирует бусины в одном миллилитре PBS с двумя микролитрами 10% веса на объем. Азид для длительного хранения. Измерьте концентрацию шариков в суспензии с помощью гемоцитометра, обычно она составляет один-два раза от 10 до девяти бусин на миллилитр.

Заполните тюбик азотным колпачком и храните его при температуре четыре градуса Цельсия в темноте. Начните эту процедуру с забора экспоненциально растущих клеток алиума из 10-сантиметровой тарелки чашки Петри. Разную плотность клеток на трехсантиметровых чашках с оптически прозрачным пластиковым или стеклянным дном и выращиваем их в течение ночи на следующее утро.

Выберите посуду, которая примерно на 80% сливается для использования в эксперименте. Замените питательную среду средой с низким потоком или средой LF и инкубируйте в течение двух часов до начала эксперимента с целью снижения внеклеточной и внутриэндосомальной аутофлуоресценции культуральной среды HL с пятью С. Растопите 10 миллилитров 1,5%-го BDO агара в среде LF, и вылейте агар на плоскую поверхность для того, чтобы образовался слой агара толщиной около одного миллиметра.

Подождите от 10 до 15 минут, чтобы агар застыл. Разрежьте слой агара на квадраты два на два сантиметра и поместите в среду НЧ на потом. Использование. Отремонтируйте широкопольный микроскоп.

Установите температуру климатической камеры на 22 градуса Цельсия и отрегулируйте необходимые для эксперимента настройки. После двухчасовой инкубации отсадите среду LF из трехсантиметровой чашки, но оставьте монослой клетки, покрытый тонкой пленкой среды. Разведите ранее подготовленные бусины, покрытые покрытием ОБГ, в соотношении 1,5 раза по 10 до седьмой бусины на миллилитр и добавьте 10 микролитров на слой клеток.

Возьмите один квадратный лист агара и слейте лишнюю жидкость, но держите агар влажным. Аккуратно выложите квадрат агара поверх клеточного слоя. Накладка из агара увеличивает контакт между шариками и клетками, тем самым улучшая поглощение.

Он также немного сжимает клетки, удерживая их лучше в фокальной плоскости объектива. Закройте блюдо крышкой для успеха эксперимента. Не перемещайте накладку AGA, когда она покрывает клетки, а также очень важно немедленно начать этап визуализации.

Далее поставьте чашку на предметный столик микроскопа и автоматически делайте снимки в красном, зеленом и фазовом каналах каждую минуту в течение двух часов или дольше. Чтобы измерить выработку АФК, выберите и сосредоточьтесь на клеточных событиях, которые содержат весь процесс фагоцитоза. Используя профессиональное программное обеспечение для обработки изображений, объедините оптимизированные три канала и соберите изображения в фильм.

Количественно оцените интенсивность флуоресценции каждой из выбранных бусин в красном и зеленом каналах. Соотношение красного и зеленого цветов будет отражать динамическую выработку FOMO R os клетками. Чтобы сначала измерить внутриклеточную продукцию супероксида, соберите 180% конфлюентную чашку алиума в 10 миллилитрах HL пяти C-средних, затем центрифугируйте алиевые клетки при 850-кратном G в течение пяти минут и осторожно и полностью отасканируйте ресуспензионные клетки среды в ячейках с подсчетом буфера SS 6,4 и разбавьте до конечной плотности шесть раз по 10 до шести клеток на миллилитр.

Добавьте по 50 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку белого непрозрачного 96-луночного планшета, разведенного дигидроэтидием или запасом DHE в 500 раз с буфером SS 6,4. А затем с помощью многоканальной пипетки дозируйте 50 микролитров разбавленного DHE в каждую лунку 96-луночного планшета. Конечная концентрация DHE составляет 30 микромоляров.

Реакция начнется незамедлительно. Стимулы или ингибиторы могут быть добавлены в этот момент или в другие моменты времени в соответствии с конкретными потребностями. Инкубируйте клетки со средним встряхиванием при температуре 22 градуса Цельсия.

Считывание флуоресценции с помощью флуоресцентного микропланшетного ридера каждые две минуты в течение одного часа. Используйте режим верхнего считывания конечной точки с флуоресцентным возбуждением на 522 нанометрах и излучением на 605 нанометрах. Начните эту процедуру с подготовки 96-луночного планшета с диевыми ячейками, как показано в предыдущем сегменте.

Приготовьте разведенную пероксидазу хрена или HRP, добавив пять микролитров бульона HRP в 10 миллилитров буфера SS 6,4. Переверните трубку, чтобы хорошо перемешать и держать на льду. Разведенный раствор HRP находится на уровне 0,05 единиц на миллилитр.

Приготовьте смесь plex ultra red или реакционную смесь UR, смешав бульон UR и разбавленный раствор HRP в буфере SS 6,4 до конечной концентрации 6,25. Микромоляр А УР и 0,005 единицы на миллилитр. HRP добавьте по 50 микролитров смеси UR в каждую лунку.

Реакция начнется незамедлительно. Стимулы или ингибиторы могут быть добавлены в этот момент или в другие моменты времени в соответствии с конкретными потребностями. Инкубируйте клетки со средним встряхиванием при температуре 22 градуса Цельсия.

Считывание флуоресценции с помощью флуоресцентного микропланшетного ридера каждые две минуты в течение одного часа. Используйте режим верхнего считывания конечной точки с флуоресцентным возбуждением на 530 нм и излучением на 590 нм. Эффективность покрытия флуоресцеина OB g проверяется с использованием перекиси водорода и HRP для окисления покрытых гранул in vitro и проверки спектра излучения с использованием возбуждения на 500 нанометрах.

Как показано на этом графике, окисленные шарики демонстрируют значительный пик эмиссии на уровне 538 нанометров по сравнению с неокисленными бусинами с коэффициентом интенсивности, по крайней мере, от 11 до 12 раз. Генерация АФК в фагосомах в клетках дия может быть визуализирована качественно и динамически с помощью микроскопии, как показано в этом репрезентативном фильме с интервальной съемкой, записанном в течение 40 минут с использованием шестикратного увеличения в течение первой минуты после всплеска. При фагоцитозе флуоресценция флуоресцентных шариков OBG изменялась с красной на ярко-оранжевую, что указывает на то, что АФК, вероятно, вырабатываются непосредственно внутри фагосом.

Производство внутриклеточного супероксида и внеклеточной перекиси водорода количественно измеряется с помощью анализов DHE и UR соответственно. Приведена краткая информация о биохимических реакциях, связанных с этими двумя анализами. Супероксид преобразуется в перекись водорода с помощью супероксиддисмутазы или SOD, а перекись водорода преобразуется в воду и кислород с помощью каталазы в анализе DHE.

Считыватель микропланшетов используется для количественного измерения внутриклеточного супероксида со средней пропускной способностью. Репрезентативный эксперимент показывает, что при стимуляции липополисахаридом LPSA из кишечной палочки динамическое образование супероксида из клеток AX two значительно выше, чем базальный уровень из нестимулированных клеток AX two, а фон реакции в буфере, снижение синей флуоресценции и увеличение красной флуоресценции обратно коррелируют. Как и ожидалось.

Локализация продукции Ros, измеренная с помощью анализа DHE, подтверждается следующими результатами. Добавление мембраны D-E-D-T-C-A через ингибитор супероксиддисмутазы усиливало сигнал DHE дозозависимым образом, указывая на то, что D-E-D-T-C вызывает накопление субстрата супероксиддисмутазы. В качестве альтернативы, добавление мембранного гасителя перекиси водорода IMP не влияло на образование супероксида в анализе A UR.

Считыватель микропланшетов используется для количественного измерения производства внеклеточной перекиси водорода со средней пропускной способностью. Репрезентативный эксперимент показывает, что при стимуляции ЛПС динамическая продукция перекиси водорода из клеток AX two значительно выше, чем базальный уровень из нестимулированных клеток AX two, а фоновая реакция при обработке различными концентрациями D-E-D-T-C или каталазы сигнал A UR уменьшается дозозависимым образом из-за ингибирования продукции перекиси водорода из внутриклеточного супероксида и истощения внеклеточной перекиси водорода соответственно. Лечение D-E-D-T-C и каталазой однозначно подтвердило, что анализы DHE и UR специфически измеряют различные типы и субклеточные локализации ROS Indicum после этой процедуры.

Другие методы, такие как зеркальное воспроизведение генерации Росса во время заражения патогенными или непатогенными бактериями, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, как жеребец Dictal будет реагировать на различные бактериальные инфекции с точки зрения генерации потерь. И не забывайте, что работа с патогенными бактериями, такими как микробактерии марум, может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует принимать меры предосторожности, такие как соответствующие меры BSL.