Всего экстракции белка и 2-D электрофореза в геле Методы

Общая цель данной процедуры заключается в создании двумерной карты бактериального протеома. Для этого сначала выращивают бактериальную культуру и выделяют белки. Затем выделенные белки разделяют в одном измерении в зависимости от их pH.

После разделения в первом измерении методом изоэлектрического фокусирования белки подвергаются дальнейшему разделению во втором измерении в соответствии с их молекулярной массой. В завершение гель второго измерения окрашивают для визуализации белков. Таким образом, с помощью двумерного электрофореза можно получить результаты, демонстрирующие различия в экспрессии белков.

Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области бактериального патогенеза, например, какие белки вырабатываются при определенных условиях и чем различаются различные бактериальные изоляты по продукции белков? Эта информация может помочь выявить белки-кандидаты, которые могут быть задействованы в вирулентности. После выращивания 100 milliliter культуры cold dairy до стационарной фазы перенесите 35 milliliters в центрифужную пробирку и центрифугируйте при 4, 500 Gs и четырех градусах Celsius в течение 20 минут.

Ресуспендируйте осадок в 35 миллилитрах холодного PBS и повторите центрифугирование. После ресуспендирования осадка в одном миллилитре холодного PBS перенесите раствор в стерильную микропробирку объемом два миллилитра и снова центрифугируйте. Повторите промывку в одном миллилитре холодного PBS перед центрифугированием при температуре четыре градуса Цельсия и 14, 000 Gs в течение одной минуты, удалите супернатант и добавьте один миллилитр раствора P-B-S-E-D-T-A-P-M-S-F; перенесите растворенный осадок в пробирку с завинчивающейся крышкой объемом два миллилитра, содержащую около 0.5 миллилитров предварительно стерилизованных стеклянных шариков.

Затем для разрушения клеток в холодном помещении используйте мини-бидбитер трижды по одной минуте, помещая образец на лед после каждого цикла; центрифугируйте в течение одной минуты перед переносом супернатанта в стерильную полистирольную пробирку объемом 5 мл. Для увеличения выхода повторите гомогенизацию с помощью бусин дважды, добавив дополнительную аликвоту P-B-S-E-D-T-A-P-M-S-F. Соберите образцы.

Затем, после определения количества белка, храните аликвоты по 200 µg при температуре -80 °C до начала первого этапа разделения. Изоэлектрический фокусинг (IEF) начинают с очистки держателей полосок с помощью специализированного очищающего раствора, после чего полоски промывают водой Milli-Q.

Затем оставьте их в перевернутом состоянии до полного высыхания, после чего присвойте каждому образцу номер держателя гелевых полосок. Внесите предварительно подготовленный образец белка массой 200 microgram в боковую лунку держателя полосок и с помощью пипетки распределите образец по всей длине держателя, используя чистый пинцет. Извлеките гелевые полоски из упаковки.

Затем снимите защитный слой с гелевых полосок, после чего аккуратно приложите их шероховатой стороной вниз плавным скользящим движением, чтобы полоски смочились от отрицательного конца к положительному. Чтобы предотвратить перегрев, поместите фильтровальную бумагу, смоченную стерилизованной водой, поверх электрода и под гелевые полоски. Удалите пузырьки воздуха и нанесите тонкий слой минерального масла, чтобы предотвратить высыхание.

Установите держатели гель-полосок в аппарат для иэФ. Проведите анализ образцов, используя программу, указанную здесь. Гели можно извлечь в любой момент во время выполнения последнего этапа.

По завершении программы извлеките стрипы из держателей и, если они не будут использованы немедленно, оберните их пищевой пленкой и храните при температуре minus 80 degrees Celsius до начала проведения электрофореза в полиакриламидном геле с SDS (SDS-PAGE) во втором измерении. После сборки аппарата для литья гелей для SDS-PAGE приготовьте раствор геля в колбе с вакуумным наконечником и магнитным перемешивателем, добавив 1.5 molar tris buffer и MCU water; удалите пузырьки воздуха из раствора при умеренной скорости вакуумирования в течение 20 минут. После завершения вакуумирования добавьте 10% SDS в раствор геля, аккуратно вводя его пипеткой по стенке колбы. Чтобы избежать появления пузырьков, затем добавьте свежеприготовленные персульфат аммония и TEMED и перемешайте.

Залейте гель и дайте ему застыть, затем растворите DTT в предварительно приготовленном уравнивающем растворе. Извлеките полоски из хранения при -80 °C, разверните их, поместите IPG-полоски гелевой стороной вниз в буфер и инкубируйте в течение 30 минут. Затем добавьте 4,5 литра электрофоретического буфера в камеру для электрофореза.

Затем с помощью пинцета извлеките полоски из равновесного раствора и промокните излишки буфера бумажным полотенцем. Разберите устройство для отливки геля и промойте стеклянные пластины теплой водой. Заменив воду на поверхности геля бегущим буфером, с помощью чистого пинцета поместите полоску на длинную пластину так, чтобы сторона с гелем была обращена к вам.

Смажьте полоску буфером 1x и с помощью пластического шпателя сдвиньте IPG-полоску ниже вплотную к гелю, удаляя все пузырьки воздуха между полоской и гелем. Нанесите на верхнюю часть полоски раствор для герметизации agarose, чтобы зафиксировать ее на месте. После повторения этого процесса для всех полосок поместите их в камеру для электрофореза.

Убедившись, что уровень 1x буфера во внешней камере соответствует заданному значению, установите верхнюю камеру. Поместите рамку верхней буферной камеры поверх стеклянных пластин и нажмите. Добавьте 2x рабочий буфер в верхнюю камеру до средней отметки.

Затем добавьте 1x бегущий буфер во внешнюю камеру до достижения верхней отметки. Закройте крышкой, включите установку для электрофореза и блок питания. Проводите электрофорез образцов в течение ночи при 52 вольтах, 96 миллиамперах и пяти ваттах.

Проводите электрофорез до тех пор, пока фронт движения не достигнет отметки в один сантиметр от нижнего края. По завершении разделите пластины из кассеты. После извлечения гелей из стеклянных пластин зафиксируйте их в растворе один в течение как минимум одного часа или на ночь при температуре четыре градуса Цельсия.

Затем перенесите гели в раствор для фиксации №2 и поместите на качалку на один час. Промойте гели в воде Milli Q четыре раза по 15 минут. Затем окрасьте гели раствором нитрата серебра в течение 30 минут или до 48 часов.

После промывки гелей в течение одной минуты в воде Milli Q перенесите их в раствор для проявления до окрашивания геля. Примерно через 5–30 минут, чтобы остановить реакцию, перенесите гели в стоп-раствор на 10 минут. Здесь представлен гель с окрашиванием кумасси синим белков, экстрагированных из целых клеток *O. dia multivorans*.

Клинические изоляты, выращенные в бульоне LB или дрожжевом маннитном бульоне и собранные в стационарной фазе. Сравнительный анализ профилей белков, экстрагированных из одних и тех же бактериальных культур в два разных приема, показал схожий характер полос, что свидетельствует об успешной экстракции белков. На данном рисунке анализ методом 2D-гель-электрофореза 200 µg общего белка из Bural dio, pseudo демонстрирует наличие более 500 пятен, каждое из которых может быть идентифицировано с помощью масс-спектрометрии.

После выполнения этой процедуры можно применить другие методы, например цитометрию, для определения количественных и качественных различий между близкородственными бактериальными изолятами. Кроме того, при модификации метода окрашивания исследователи могут определить идентичность белковых пятен путем вырезания пятен и масс-спектрометрии.