Семя пальто постельных принадлежностей Анализ чтобы Генетически Путешествуйте

Общая цель данной процедуры заключается в организации анализа на подложке из семенных оболочек для изучения того, как эндосперм контролирует прорастание семян rabbit opsis в ответ на различные условия окружающей среды как на генетическом уровне, так и in vitro. Это достигается путем предварительного осторожного отделения семенной оболочки и зародыша из семени Arab Opsis с помощью иглы шприца и укороченного пинцета. На втором этапе отделенные семенные оболочки аккуратно переносят на среду для проращивания.

Затем семенные кожухи собирают в один круговой слой. На заключительном этапе зародыши размещают в центре сформированного слоя семенных кожухов. Также в виде одного кругового слоя.

Эндосперм играет важнейшую роль в контроле прорастания семян в наших исследуемых семенах. Анализ изгиба семенной кожуры представляет собой процедуру генетической системы in vitro для идентификации молекулярно-генетических компонентов сигнальных путей, действующих в эндосперме для контроля прорастания семян. Как правило, новички в этом методе сталкиваются с трудностями, так как быстро препарировать зародыш, не повредив его, довольно сложно.

Также важно учитывать возраст исходного материала, поскольку с возрастом он может терять способность контролировать детерминацию клеток. Начните с того, что перенесите от 50 до 60 µL зрелых сухих семян Arab opsis в микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 mL. Затем добавьте в пробирку 1 mL 70% этанола и перемешайте семена при комнатной температуре на вортексе, установив скорость 1200 RPM. Через 10 минут центрифугируйте пробирку в течение трех секунд при 4,000 Gs, чтобы осадить семена на дно пробирки.

Затем с помощью вакуумного наконечника осторожно аспирируйте этанол, оставив семена на дне пробирки. Теперь добавьте к семенам 1 мл стерильной дистиллированной воды и перемешивайте их в течение еще 10 минут. После повторного центрифугирования семян аспирируйте надосадочную жидкость и добавьте в пробирку еще 1 мл стерильной дистиллированной воды, следя за тем, чтобы поток воды равномерно суспендировал семена по всему объему пробирки.

Затем поместите пробирку в штатив, чтобы семена осели на дно. Примерно через 30 секунд осторожно аспирируйте воду для высева семян. Сначала налейте 30 milliliters свежеприготовленной среды для прорастания с температурой 50 °C в чашку Петри диаметром 100 millimeter. Ресуспендируйте семена в 200 microliters стерильной дистиллированной воды, а затем с помощью наконечника микропипетки объемом 1 milliliter перенесите их на поверхность среды для прорастания.

Отосприруйте воду вокруг семян, затем оставьте чашку Петри с семенами открытой в ламинарном шкафу для дальнейшего высушивания. Через два часа закройте чашку Петри и оставьте семена в шкафу еще на 90 минут. Теперь поместите стереомикроскоп внутрь шкафа.

Налейте 30 миллилитров среды для проращивания в другую чашку Петри диаметром 100 миллиметров, затем поместите на поверхность среды два расположенных рядом прямоугольных стерилизованных в автоклаве кружка фильтровальной бумаги Whatman диаметром 3 миллиметра. Самым сложным этапом данной процедуры является препарирование, так как семя очень тонкое, поэтому при разрезании семени, зафиксированного стерильным пинцетом Dumont № 5 с тупым концом, необходимо соблюдать крайнюю осторожность, чтобы не повредить зародыш.

Перенесите семена на бумагу, удерживая пинцет закрытым. Осторожно вдавите каждое семя в бумагу. Затем с помощью кончика инсулиновой иглы калибра 29 gauge сделайте надрез семенной кожуры вдоль самой длинной главной полуоси как можно ближе к месту соединения семядольных проводящих пучков с корешком.

Затем с помощью пинцета прижмите семя к бумаге. Снова приложите давление к кончику Cains, максимально близко к кончику корешка, чтобы освободить зародыш из семенной кожуры для сборки анализа на подложке из семенной кожуры. Сначала поместите кусочек стерильной нейлоновой сетки размером 3,5 на 5 см в еще одну свежезалитую чашку диаметром 100 мм со средой для прорастания.

Затем с помощью шприца осторожно переместите зародыши и семенные кожуры на металлические края пинцета и перенесите растительные ткани на нейлоновую сетку. Используя пинцет и шприц, сформируйте из семенных кожур один круговой слой, стараясь расположить их максимально плотно друг к другу так, чтобы отверстия в кожурах были направлены вверх. Затем поместите зародыши одним круговым слоем в центр слоя из семенных кожур, также обеспечивая максимально плотное расположение зародышей.

Наконец, инкубируйте пробы на подложке из морского песка при непрерывном освещении и температуре от 20 до 21 °C, в соответствии с предыдущими результатами. Семена мутанта rabbit opsys, неспособного синтезировать gier illin, или GA-дефицитные мутанты не прорастают через 80 часов после имбибиции семян. Напротив, и в дальнейшем соответствии с предыдущими результатами, удаление семенной кожуры стимулирует рост зародыша GA-дефицитного мутанта, если в среде отсутствует OB CIC acid или BA, что позволяет предположить, что эндосперм GA-дефицитных мутантов высвобождает BA в сторону зародыша для блокирования его прорастания.

На данном изображении показан анализ на подложке из семенных оболочек через 80 часов после ингибирования семян, где эмбрионы мутантов с дефицитом GA помещены на слой из 80 семенных оболочек мутантов с дефицитом GA. В соответствии с нашей гипотезой, семенные оболочки мутантов с дефицитом GA блокируют рост эмбрионов мутантов с дефицитом GA. Здесь представлен анализ на подложке из семенных оболочек с эмбрионами мутантов с дефицитом GA, культивируемыми на слое семенных оболочек мутантов с дефицитом GA, которые также лишены способности синтезировать A BA; как и ожидалось, через 80 часов после ингибирования семян мутантные семенные оболочки оказываются неспособными блокировать рост эмбрионов мутантов с дефицитом GA.

Аналогично, эмбрионы мутантов с дефицитом GA, культивируруемые на подложке из семенных оболочек мутантов с дефицитом GA, у которых отсутствует фактор RGL2, также не могли блокировать рост эмбрионов мутантов с дефицитом GA после выполнения данной процедуры. Другие методы, такие как анализ экспрессии генов в семенных оболочках и эмбрионах, выделенных из семян, могут быть применены для исследования генетического взаимодействия с использованием метода погружения семенных оболочек. Таким образом, после освоения данной техники исследователи в области прорастания семян смогут изучить, как семенная оболочка контролирует рост эмбриона в ответ на сигналы окружающей среды в нашей системе.