Выделение и Th17 дифференцировки наивных CD4 Т-лимфоцитов

Общей целью этой процедуры является дифференцировка клеток TH 17 от наивных CD четырех положительных Т-лимфоцитов. Это достигается путем сбора лимфатических узлов и селезенки у взрослой мыши C 57 black six. На втором этапе ткани измельчаются для получения одноклеточной суспензии.

Затем CD четыре положительные CD 25 отрицательные Т-клетки выделяют и культивируют в условиях контроля, индуцирующих или активирующего TH17. В конечном счете, Q-P-C-R-E-I-S-A и проточная цитометрия могут быть использованы для оценки экспрессии IL 17 A. Таким образом, этот метод может дать представление о дифференцировке CD четырех Т-лимфоцитов в Т-817 клеток у черных шести мышей C 57.

Его также можно применять к другим моделям мышей. Демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как лимфатические узлы очень малы, что затрудняет этапы диссекции. Без прямой визуализации этого метода, по крайней мере, за четыре часа до добавления клеток покройте лунки нового 96-луночного микротестового планшета UBO для микротестовой культуры тканей 30 микролитрами анти-CD трех, разведенными в стерильном PBS, постукивайте по боковым сторонам планшета, чтобы обеспечить равномерное покрытие лунок, а затем инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия через четыре часа. Охладите тарелку до тех пор, пока не придет время добавлять ячейки.

После подтверждения смерти от вывиха шейки матки стерилизуйте область разреза взрослой мыши C 57 black six с 70% этанолом. Затем захватите кожу перед отверстием уретры и разрежьте от вентральной средней линии до области подбородка, стараясь не нарушить брюшину. Затем прикрепите кожу, чтобы обеспечить доступ к лимфатическим узлам и селезенке для удаления.

Теперь удалите подмышечные лимфатические узлы, расположенные рядом с подмышечной впадиной мыши за грудными мышцами, и поместите ткань в чашку Петри, содержащую пять миллилитров буфера для бега AutoMax. Затем удалите плечевые лимфатические узлы, расположенные в соединительной ткани возле каждой подмышечной впадины. Затем удалите поверхностные шейные лимфатические узлы, расположенные на шее животного, фланкирующие трахею, а затем удалите паховые лимфатические узлы, расположенные в области бедер на стыке трех кровеносных сосудов.

Чтобы получить доступ к брыжеечным лимфатическим узлам, сначала разрежьте вентральную срединную линию через перитонеальную оболочку. Брыжеечные лимфатические узлы расположены глубоко внутри брыжейки мыши, как правило, в виде цепочки из четырех-восьми узлов, которые могут выглядеть как нитка жемчуга. Удалите селезенку, вытягивая и отделяя ее от поджелудочной железы.

Затем поместите его в чашку Петри с лимфатическими узлами, чтобы измельчить органы. Поместите лимфатические узлы на матовую сторону одного предметного стекла, а затем потрите ткани матовой стороной второго предметного стекла. Чтобы отфильтровать измельченные органы в одноклеточную суспензию, сначала несколько раз сложите кусок нейлонового материала размером примерно три на три дюйма размером 40 микрон и поместите его в верхнюю часть центрифужной пробирки объемом 15 миллилитров.

Используйте пятимиллилитровый шприц, оснащенный иглой 21 калибра, для аспирации клеток и буфера, а затем медленно дозируйте раствор клеток в сложенный нейлон. Следите за тем, чтобы не проколоть материал иглой. После того, как получена суспензия одиночных клеток, раствор должен выглядеть согласованным без видимых кусочков твердой ткани.

Поместите этот раствор на лед. После сортировки клеток методом AutoMax разделение до не менее 80% CD четырех положительных CD 25 отрицательной чистоты клеток. Подсчитайте клетки методом исключения трианового синего цвета, а затем разбавьте клеточную суспензию до 10-6 клеток на миллилитр в среде для клеточных культур.

Теперь промойте все лунки анти CD трех покрытых пластин 200 микролитрами PBS. Каждый выбрасываем стирку в контейнер для отходов. Затем добавьте 100 микролитров индуцирующих коктейльных или активационных контрольных смесей TH 17 в соответствующие лунки в трех экземплярах.

Наконец, добавьте 100 микролитров клеток в каждую лунку и инкубируйте клетки в течение не менее 72 часов или до пяти дней для достижения дифференцировки клеток TH 17 для Eli SA и QPCR. По истечении инкубационного периода отбивайте каждый образец по три раза в отдельные пробирки эйнора. После вращения клеток перенесите надосадочную жидкость в отдельные эйноровские пробирки и храните при температуре минус 20 градусов Цельсия, чтобы позже измерить выработку IL 17 A с помощью ELI.

A.To подготовьтесь к КПЦР после удаления надосадочной жидкости ресуспенд, оставшиеся гранулы по 175 мкл, буфер для лизиса РНК для немедленного извлечения РНК или храните при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока не будете готовы начать процедуру после инкубационного периода. При подготовке к активации клеток до IL 17 внутриклеточный пул окрашивания каждой из индуцирующих или активирующей контрольных клеток TH 17 утраивается в отдельные лунки 24-луночного клеточного культурального планшета. Добавьте в каждую лунку по 400 микролитров среды для клеточных культур.

Чтобы довести общий объем до одного миллилитра, затем добавьте в каждую лунку ион ПМА мицин и фельден А и инкубируйте клетки в течение четырех часов при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы обнаружить наличие IL 17 А с помощью внутриклеточного окрашивания и проточной цитометрии. Сначала перенесите ячейки из каждой лунки 24-луночного планшета в отдельную эйнорскую трубку. Затем раскрутите трубки вниз.

Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточные гранулы в 200 микролитрах факс-буфера. Перенесите ресуспендированные клетки в 96-луночный проточный цитометрический планшет и снова раскрутите клетки после промывки гранул в 200 микролитрах факс-буфера, ресуспендируйте клетки в 100 микролитрах факс-буфера и добавьте 100 микролитров смеси для окрашивания внеклеточными антителами. Выдерживать в течение 15 минут при комнатной температуре вдали от света.

После двукратной промывки клеток инкубируйте гранулы в 100 микролитрах BD cyto. Фиксацию цитозавивочной завивки буфером накрывают пленкой на 20 минут при комнатной температуре. Теперь промойте клетки дважды в 100 микролитрах одного буфера для химической завивки X BD, а затем инкубируйте клетки в 50 микролитрах внутриклеточной смеси антител, накрытой фольгой, в течение 15 минут при комнатной температуре.

После промывания клеток снова резусируют, суспензируют клетки в 200 микролитрах буфера для окрашивания BD, а затем пересадят клетки в пробирки проточной цитометрии, содержащие 200 микролитров окрашивающего буфера. Храните пробирки при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока они не будут готовы к считыванию для проточного цитометрического анализа образцов первого затвора на популяции живых клеток. Затем используйте популяцию живых клеток для гейтирования CD-4-положительной CD-восьми-отрицательной популяции.

Наконец, из CD 4 положительных CD восемь отрицательных популяционных походок на IL 17 A положительной популяции для дифференцировки клеток TH 17 нефракционированные объединенные лимфатические узлы и селезенки должны быть обогащены для CD четырех положительных CD 25 отрицательных Т-клеток. На этом рисунке показаны нефракционированные объединенные клетки лимфатических узлов, SP-циты и разделенные на AutoMax фракции TT-клеток, окрашенные анти-CD 4 и анти-CD 25. На этой первой точечной диаграмме показан репрезентативный профиль процентного соотношения CD 4 положительных, CD 25 положительных и CD четырех положительных CD 25 отрицательных лимфоцитов, присутствующих в нефракционированных объединенных лимфатических узлах и клетках селезенки.

Процедура выделения также обеспечивает обогащенную популяцию CD 4 положительных CD 25 положительных трегов, которая может быть использована в дополнительных экспериментах. На этой последней диаграмме рассеяния показано желаемое обогащение клеток популяцией, которая составляет 84% CD четырех положительных CD 25 отрицательных Т-клеток. Эта обогащенная популяция CD 4 положительных CD 25 отрицательных Т-клеток помогает обеспечить более успешную дифференцировку TH 17, как показано на этом рисунке.

В то время как инкубация CD четырех положительных CD 25 отрицательных Т-лимфоцитов с анти CD 3 и анти CD 28 в течение пяти дней дает CD 25 положительных Т-лимфоцитов, инкубация в условиях, индуцирующих TH 17, дает подмножество IL 17, продуцирующих CD четыре положительных CD 25 положительных лимфоцитов. Статус дифференцировки TH 17 может быть дополнительно оценен с помощью количественной ПЦР и Elis A, здесь данные из обогащенных CD четырех положительных CD 25 отрицательных Т-лимфоцитов, инкубированных в контрольном режиме, или условий, индуцирующих TH 17, показывают CD 4 положительные. CD 25 отрицательные Т-лимфоциты, инкубированные в условиях TH 17, активируют IL 17 A, что может быть установлено с помощью QPCR и ELI SA. Специфический для TH 17 фактор транскрипции ROAR гамма-Т также активируется CD четырьмя положительными CD 25 отрицательными Т-клетками, инкубированными в условиях, индуцирующих TH 17, что может быть измерено с помощью QPCR.

При проведении этой процедуры важно помнить о достижении чистоты клеток не менее 80% CD 4 положительных CD 25 отрицательных перед инкубацией клеток в условиях, индуцирующих TH 17. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как препарировать лимфатический узел и селезенку у мышей C 57 black six, как инкубировать клетки при T eight 17 или условиях контроля активации, а также как оценить дифференцировку наивных CD четырех Т-лимфоцитов в T eight 17 клеток South.