Клеточная Протокол анализа для прогностического Прогнозирование идиопатический сколиоз с помощью сотового диэлектрической спектроскопии

Общей целью данного эксперимента является прогнозирование прогноза идиопатического сколиоза в соответствии с функциональной группировкой пациентов путем скрининга их ответа PBM C'S на активацию GPCR R с помощью клеточной диэлектрической спектроскопии. Это достигается путем культивирования pbmc в присутствии фитогемагглютинина или PHA для увеличения количества клеток. Расширение ячейки завершается в трубке, поддерживаемой в наклонном положении.

В качестве второго шага клетки обрабатываются остеопонтином или OPN, который увеличивает или снижает активность белка GI. В зависимости от пациента после лечения клеточная суспензия переносится в микропланшет. Затем клетки стимулируют агонистами GI или GS GPCR для определения результирующих изменений импеданса.

Результаты обеспечивают кинетические отклики для всех скважин, а затем количественно оцениваются интегрированные отклики на основе изменений импеданса. Применение этого метода выходит далеко за рамки простого диагноза. Таким образом, впервые мы можем выявлять пациентов с симптомами риска развития сколиоза на ранней стадии, и теперь, зная, у кого разовьется сколиоз или на какой стадии они находятся, мы можем предложить новые методы лечения для их лечения.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как рентгеновское облучение, заключается в том, что эта методика позволяет прогнозировать прогнозный остеопатический сколиоз без необходимости измерения ковида и без риска для здоровья. Самой последней методикой теперь будет заниматься наш научный сотрудник Нита Франко, размораживание замороженных аликвот мононуклеарных клеток периферической крови в водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. С помощью стерильной пипетки перенесите клеточную суспензию в 50 миллилитровую пробирку, содержащую 15 миллилитров готовой среды, и центрифугу.

Клетки отсасывают надосадочную жидкость. Затем аккуратно суспензируйте ячейку гранулы в одном миллилитре среды PHA, доведите объем до 20 миллилитров с той же крышкой пробирки неплотно, чтобы воздух мог войти. Инкубируйте пробирку в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе с углекислым газом, чтобы позволить покоящимся лимфоцитам превратиться в быстро пролиферирующие лимфобласты.

Полностью закрутите крышки и гранулируйте ячейки центрифугированием. Удалите надосадочную жидкость путем аспирации. Аккуратно суспензируйте клеточную гранулу в одном миллилитре готовой среды.

Доведите объем до 20 миллилитров с той же средой и неплотно закупорьте пробирку, закваливая культуру на ночь, чтобы увеличить количество клеток. После двух промывок 10 миллилитрами RPMI 1640 аккуратно ресуспендируйте клеточную гранулу в 600 микролитрах RPMI 1640. Измеряйте концентрацию и жизнеспособность клеток с помощью автоматического счетчика клеток и анализатора жизнеспособности.

Затем добавьте соответствующий объем RPMI 1640, чтобы довести концентрацию клеток 1,5 умножить на 10 до пятой клетки на 20 микролитров. Перелейте 100 микролитров суспензии в две стерильные 1,5 миллилитровые пробирки. Добавьте рекомбинантный остеопонтин в одну пробирку до конечной концентрации 0,5 мкг на миллилитр.

Добавьте равный объем PBS во вторую пробирку. Аккуратно перемешайте каждое условие путем дважды пипетирования с помощью стерильной пипетки, набранной в объеме 100 микролитров. Затем добавьте пять микролитров RPMI 1640 в каждую лунку 96-луночного планшета центрифугируйте планшет при давлении 200 GS в течение трех минут, чтобы удалить любые пузырьки воздуха для переноса клеток из пробирки в микропланшет.

пипеткой вверх и вниз по одному разу, чтобы обеспечить равномерную суспензию клеток. Засейте 40 микролитров клеточной суспензии в лунку в четырехкратном дубликате для необработанных клеток и в двух экземплярах для клеток, обработанных ROPN или PBS. Оставьте камерную пластину под стерильным колпаком на пять минут, чтобы клетки могли отдохнуть и равномерно осесть на дно лунки.

Для оптимизации эффекта культуры ОПН клетки в течение 18 часов при температуре 37 градусов Цельсия в углекислом инкубаторе уравновешивают культуры при комнатной температуре в течение примерно 30 минут. Тем временем приготовьте один миллилитр 100 микромолярного соматостатина и изопротеренола в RPMI 1640. Заполните составную пластину, раздав 20 микролитров в соответствующие лунки.

Накройте составную пластину отверждаемым уплотнением. Загрузите пластину, наконечники для дозатора и составную пластину в систему на основе CDS. Назовите пластину в программном обеспечении прибора на основе CDS.

Перейдите к списку протоколов и выберите подходящий протокол для инициирования протокола. Нажмите «Начать». Интегрированная жидкостная система одновременно добавляет компаунды во все скважины.

Система на основе CDS автоматически собирает данные в течение 15 минут после того, как жизнеспособность клеток compound edition была сопоставима между всеми образцами со значениями, соответствующими диапазону от 86 до 96%. Среди образцов из 32 использованных образцов два имели недостаточное количество ячеек и не были классифицированы. В этом примере показана функциональная классификация в соответствии со степенью дисбаланса между ГИ и передачей сигналов ЖКТ.

Оценка эффекта OPN в ответ на стимуляцию ЖКТ показала, что OPN усиливает ответ у пациентов 353 и 371. Напротив, ответ был снижен более чем на 50% у пациентов 345 и 382 и менее чем на 50% у пациентов 370 после лечения ROPN. Таким образом, в соответствии с нашими критериями классификации, мы смогли классифицировать пациентов 353 и 371 в СГ 1, пациентов 300 из 45 и 382 в СГ 2 и пациента 370 в СГ 3.

Параллельно с этим все пациенты были обследованы на предмет их реакции на стимуляцию желудочно-кишечного белка и сравнены с контрольной группой. Как и ожидалось, все пациенты были менее восприимчивы, чем контрольные субъекты. Пациенты, отнесенные к одной функциональной группе, продемонстрировали сходные уровни максимального ответа.

Классификация большой когорты пациентов с СК, регулярно наблюдаемых в нашей специальной клинике в больнице Сан-Жюстин, показала, что эти три функциональные группы были распределены аналогичным образом. Среди случаев средней тяжести среди тяжелых случаев преобладала двойка СГ. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как классифицировать пациента на две, три функциональные группы с помощью клеточной диэлектрической спектроскопии.