Индуцированное теплом извлечение антигена: эффективный метод обнаружения и идентификации типов клеток-предшественников во время нейрогенеза гиппокампа у взрослого человека

Общая цель данной процедуры заключается в проведении демаскировки антигенов в тканях гиппокампа головного мозга для лучшей визуализации типов клеток-предшественников, дающих начало новорожденным нейронам. Это достигается путем предварительного извлечения перфузируемого мозга мыши, изготовления тонких корональных срезов и закрепления этих срезов на предметном стекле, специально разработанном для обеспечения сильной адгезии к ткани. Вторым этапом является кипячение стекол с тканью и последующая обработка с Kay, с предоставлением достаточного времени для охлаждения.

Затем проведите окрашивание ткани первичными антителами в течение ночи. Заключительным этапом является окрашивание ткани вторичными антителами на следующий день в течение как минимум двух часов. В итоге визуализируйте различные типы прогениторных клеток на разных стадиях развития в процессе нейрогенеза в гиппокампе взрослого организма с помощью таймлапс- или конфокальной микроскопии.

Здравствуйте, меня зовут Хан Джо, я постдок, сотрудник лаборатории доктора Яна Джона в клинике Майо. Основное направление работы лаборатории Джона — исследование процессов нейрогенеза при неврологических и психиатрических расстройствах. Наша конечная цель заключается в успешном применении этих знаний в терапевтических целях; в данном видео мы продемонстрируем процедуру демаскировки антигенов, которую проведут Куам Хуи и Джон из нашей лаборатории.

Основное преимущество нашего метода по сравнению с существующими методами иммуногистохимии заключается в том, что он позволяет эффективно визуализировать отдельные типы клеток в процессе нейрогенеза в гиппокампе взрослых особей. Эти типы клеток, включая предшественники нейральных стволовых клеток, которые в противном случае трудно обнаружить, могут быть эффективно помечены и визуализированы с помощью нашего метода восстановления антигена. Данный метод позволит глубже понять процессы развития и регуляции новорожденных нейронов во время нейрогенеза в гиппокампе взрослых особей.

Для тех, кто интересуется изучением психических расстройств и фармакологическим лечением, наш метод восстановления антигенов окажется полезным при исследовании роли развития нейронов при данном заболевании. Патогенез. Начните процедуру, поместив мозг перфузированной мыши в 4% параформальдегид в коническую пробирку объемом 10 мл на ночь при температуре четыре градуса Цельсия, или минимум на 12–24 часа, но не более 36 часов для полной фиксации. После ночной фиксации удалите PFA, оставив мозг в конической пробирке.

Затем промойте мозг 30% раствором сахарозы для удаления остатков PFA и слейте сахарозу. После этого снова наполните пробирку 30% раствором сахарозы и выдержите ее при температуре четырех градусов Цельсия до тех пор, пока мозг не осядет на дно пробирки. Затем с помощью микротома разрежьте гиппокамп на срезы мозга толщиной 40 мкм.

Храните срезы в антифризном растворе до начала проведения иммуногистохимического анализа. Затем зафиксируйте срезы на предметных стеклах, специально предназначенных для обеспечения сильной адгезии ткани. После фиксации ткани дайте стеклам высохнуть в течение примерно 10 минут.

Процесс высушивания можно ускорить, если прислонить предметные стекла к вертикальной поверхности, положив их на бумажное полотенце, чтобы обеспечить полное удаление предыдущих химических веществ. После высыхания стекол промойте их раствором PBS 3 раза по пять минут. Затем снова дайте им высохнуть.

В данной процедуре приготовьте раствор для кипячения тканей согласно описанию в сопроводительной рукописи. Затем кипятите раствор в течение пяти минут в стандартной микроволновой печи при стандартных настройках. По завершении кипячения осторожно извлеките контейнер из микроволновой печи.

После этого перенесите высушенные предметные стекла в раствор. Убедитесь, что сторона с срезами гиппокампа полностью погружена в раствор. По возможности расположите стекла под наклоном у стенок контейнера, обложив их другими стеклами.

Затем кипятите смесь с предметными стеклами в микроволновой печи в течение семи минут при стандартных настройках. Тем временем наполните два ведра для льда льдом наполовину. Как только кипячение завершится, извлеките контейнер из микроволновой печи и поместите его в одно из ведер со льдом.

Высыпьте оставшийся лед из другого ведра вокруг контейнера, чтобы полностью его закрыть. После этого оставьте его в покое на один час. Извлеките предметные стекла из контейнера.

Промойте их буфером TBST трижды по пять минут. Затем высушите предметные стекла в темноте от 5 до 10 минут или до полного высыхания. Тем временем подготовьте камеру с DDH₂O для инкубации с первичными антителами в течение ночи.

После высыхания предметных стекол обведите срезы ткани водоотталкивающим маркером. Эта граница служит барьером, предотвращающим перетекание смеси антител. Затем приготовьте смесь первичных антител в T-B-S-T-T.

Поместите высушенные предметные стекла на предметный столик в камеру для окрашивания. Медленно добавьте 500 µL первичных антител, чтобы полностью покрыть поверхность. Затем закройте камеру для окрашивания, чтобы исключить воздействие внешнего света, и оставьте стекла на ночь при комнатной температуре; на следующий день промойте стекла трижды по пять минут каждый раз буфером TBST.

После этого высушите их в темноте. Затем приготовьте смесь вторичных антител в T-B-S-T-T. После чего поместите высушенные стекла в камеру для окрашивания.

Добавьте 500 µL вторичного антитела. Медленно закройте камеру для окрашивания и защитите ее от внешнего света как минимум на два часа при комнатной температуре после завершения окрашивания вторичными антителами; затем трижды промойте предметные стекла буфером TBST по пять минут за каждую промывку и высушите их в темноте. Нанесите на предметные стекла среду для заключения препарата.

Осторожно накройте образцы покровными стеклами, чтобы не допустить попадания пузырьков воздуха. Затем выдержите стекла в темноте не менее двух часов перед последующим анализом, а также проведением анализа таймлапс-съемки или конфокального анализа окрашенной ткани. Нейрогенез в гиппокампе взрослых особей наблюдается в субгранулярной зоне зубчатой извилины.

Активированная радиальная глиальная стволовая клетка первого типа проходит через несколько различных фаз по мере дифференцировки, созревания и функциональной интеграции в нейронную сеть с формированием сложной морфологии. Каждую из этих фаз и соответствующие типы клеток можно идентифицировать по экспрессии комбинации маркеров. MCM2 является маркером пролиферации, который экспрессируется во всех типах митотических клеток-предшественников, в то время как Nesin экспрессируется в радиальных и нерадиальных глиальных стволовых клетках.

По мере дифференцировки предшественников типа A2 экспрессия Nestin сначала прекращается. Экспрессия Anti-TBR2 возрастает в постмитотическом предшественнике, при этом экспрессия MCM2 утрачивается, в то время как экспрессия DCX и NEUN определяет миграцию и созревание в функциональный нейрон. На данном репрезентативном конфокальном снимке представлено окрашивание на MCM2 (пурпурный), Nestin (зеленый) и DAPI (красный).

Увеличенные изображения в рамках демонстрируют радиальную глию, подобную клеткам-предшественственниками, экспрессирующую neston, MCM 2 и dpi. Здесь представлено репрезентативное конфокальное изображение: синий — MCM 2, красный — TBR 2, зеленый — DCX и серый — dpi. Окрашивание, характерное для типа клеток-предшественников Type 2 B, экспрессирующих MCM 2, TBR 2, DCX и dpi, показано на увеличенных изображениях в рамках.

При выполнении данной процедуры важно помнить о трех вещах. Во-первых, используйте хорошо перфузированную и фиксированную ткань соответствующей толщины коронального среза. Во-вторых, при наложении ткани на предметные стекла обеспечьте ее ровное расположение и предотвратите любые повреждения в процессе.

И наконец, третье, что позволяет выделить достаточное время для кипячения и последующего охлаждения в процессе демаскировки антигенов. После выполнения этой процедуры можно применить другие методы, такие как конфокальная реконструкция тканей и поведенческие эксперименты, чтобы ответить на дополнительные вопросы о том, как новорожденные нейроны интегрируются в нейронные сети гиппокампа и вносят вклад в когнитивную функцию. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить демаскировку антигенов в тканях гиппокампа для более эффективной визуализации репрезентативных типов клеток, которые дают начало новым нейронам в ходе нейрогенеза в гиппокампе.