Индуцированное теплом извлечение антигена: эффективный метод обнаружения и идентификации типов клеток-предшественников во время нейрогенеза гиппокампа у взрослого человека

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы провести забор антигена из ткани мозга гиппокампа для лучшей визуализации типов клеток-предшественников, дающих начало новорожденным нейронам. Это достигается путем забора перфузного мозга у мыши, вырезающей тонкие корональные срезы, и установки этих секций на предметное стекло, специально разработанное для прочного прилегания к ткани. Вторым шагом является кипячение предметных стекол с помощью салфетки и атопической обработки Кеем и предоставление достаточного времени для охлаждения.

Далее окрашивайте ткань на ночь первичными антителами. Заключительным этапом является проведение вторичного окрашивания тканей антителами на следующий день в течение не менее двух часов. В конечном счете, визуализируйте различные типы прогендерных клеток на различных стадиях развития во время взрослого нейрогенеза ткани гиппокампа с помощью замедленной съемки или конфокальной микроскопии.

Здравствуйте, меня зовут Хун Джо, я постдок, сотрудник лаборатории доктора Яна Джона и клиники Майо. Наша основная цель в Лаборатории Джона — исследование процесса другого нейрогенеза при неврологических и психических расстройствах. Наша конечная цель состоит в том, чтобы успешно перевести эти знания в терапевтическое применение, демонстрируя нашу процедуру антигенного ретривера Куам Хуэй, и привет Джону из нашей лаборатории.

Основное преимущество нашей методики перед существующими методами иммуногистохимии заключается в том, что она позволяет эффективно визуализировать различные типы клеток в процессе нейрогенеза гиппокампа взрослого человека. Эти типы клеток, в том числе предшественники нейральных стволовых клеток, которые иначе трудно обнаружить, могут быть эффективно помечены и визуализированы с помощью нашего метода извлечения антигенов. Этот метод позволит получить представление о развитии и регуляции нейронов новорожденных во время нейрогенеза гиппокампа у взрослых.

Для тех, кто заинтересован в изучении психических расстройств и фармакологическом лечении, наше извлечение антигена окажется полезным в исследовании роли развития нейронов во время этого заболевания. Патогенез. Начните процедуру с помещения мозга перфузированной мыши в 4%-ном параформальдегиде в коническую трубку объемом 10 миллилитров на ночь при четырех градусах Цельсия или на срок не менее 12-24 часов, но не более чем на 36 часов для полной фиксации. После ночной фиксации удалите ПФА и оставьте мозг в конической трубе.

Затем промойте мозг 30% сахарозой, чтобы удалить остатки PFA, и выбросьте сахарозу. Затем снова наполните пробирку 30% сахарозой и держите ее при температуре четыре градуса Цельсия, пока мозг не опустится на дно пробирки. После этого разрежьте гиппокамп на участки мозга размером 40 микрометров на микротоме.

Законсервируйте срезы в растворе антифриза до тех пор, пока они не будут готовы к иммуногистохимии. Затем закрепите срезы на предметных стеклах микроскопа, которые специально разработаны для прочного прилегания к ткани. После монтажа ткани дайте предметным стеклам высохнуть около 10 минут.

Высыхание можно ускорить, если положить предметные стекла на вертикальную поверхность на бумажное полотенце, чтобы обеспечить полное удаление предыдущих химикатов. Как только слайды высохнут, промойте их PB S3 раз в течение пяти минут каждый раз. Затем снова дайте ему высохнуть.

В этой процедуре приготовьте раствор для кипячения тканей согласно описанию в сопроводительной рукописи. Далее прокипятите раствор в течение пяти минут в стандартной микроволновке при стандартной ставке. Как только закипание завершится, осторожно достаньте емкость из микроволновой печи.

После этого переложите в раствор высушенные горки. Следите за тем, чтобы сторона с отделами гиппокампа полностью подвергалась воздействию раствора. Если возможно, разместите горки под углом к стенкам контейнера и сложите вокруг них другие горки.

Затем прокипятите смесь с горками в течение семи минут в микроволновке при стандартных настройках. Тем временем наполните льдом два ведра со льдом наполовину. Как только закипание завершится, выньте контейнер из микроволновой печи и поместите его в одно из ведерок со льдом.

Высыпьте оставшийся лед из другого ведра по всему контейнеру и полностью накройте его. После этого оставьте на один час через час. Снимите предметные стекла с контейнера.

Промойте их с TBST буфером три раза в течение пяти минут каждый раз. Затем высушите предметные стекла в темноте в течение пяти-10 минут или пока предметное стекло полностью не высохнет. Тем временем подготовьте камеру с DDH two O для ночного окрашивания первичными антителами.

После того, как слайды высохнут, нарисуйте контур вокруг участков ткани с помощью ручки для апеллянта для воды. Этот контур действует как барьер, предотвращающий вытекание смеси антител. Затем приготовьте первичную смесь антител в T-B-S-T-T.

Поместите высушенные предметные стекла на сцену в камеру окрашивания. Медленно добавьте 500 микролитров первичного антитела, чтобы покрыть всю поверхность. Впоследствии накройте камеру для окрашивания, чтобы заблокировать внешний свет, и оставьте ее на ночь при комнатной температуре на следующий день, промойте предметные стекла три раза по пять минут каждый раз с буфером TBST.

После этого просушите их в темноте. Теперь приготовьте вторичную смесь антител в T-B-S-T-T. Затем поместите сухие предметные стекла в камеру окрашивания.

Добавьте 500 микролитров вторичного антитела. Медленно накройте камеру окрашивания и держите ее от внешнего света не менее двух часов при комнатной температуре после завершения вторичного окрашивания, промойте предметные стекла три раза по пять минут каждый раз с буфером TBST, высушите стекла в темноте после высыхания. Добавьте монтажный раствор к горкам.

Накройте их покровными листами аккуратно, чтобы не допустить появления каких-либо пузырей. Затем подержите предметные стекла в темноте не менее двух часов перед последующим анализом и проведением таймлапс-анализа или экспресс-анализа окрашенной ткани. Нейрогенез взрослого гиппокампа изображен в субзерлярной зоне зубчатой извилины.

Активированная радиальная глиальная стволовая клетка первого типа проходит через различные фазы по мере того, как она дифференцируется, созревает и функционально интегрируется со сложной морфологией в нейронную цепь. Каждая из фаз и соответствующие типы клеток могут быть идентифицированы на основе их экспрессии комбинации маркеров. MCM 2 является маркером пролиферации, который экспрессируется во всех типах митотических клеток-предшественников, в то время как nein экспрессируется среди радиальных и нерадиальных глиальных стволовых клеток.

Поскольку предшественники второго типа А дифференцируются, вложенная экспрессия сначала отключается. Экспрессия Anti TBR two увеличивается в постмитотическом предшественнике MCM 2 экспрессия теряется, в то время как экспрессия DCX и NEWAN диктует миграцию и созревание в функциональный нейрон. Это репрезентативное конфокальное изображение фиолетового MCM, двух зеленых нестонов и красных пятен

Увеличенные изображения в коробках показывают радиальный предшественник GL, экспрессирующий neston MCM two и dpi. Вот репрезентативное конфокальное изображение: синий MCM, два красных, TBR, два зеленых, DCX и серый dpi. Окрашивание характеристик прогениторного типа B типа 2 показано на увеличенных изображениях в боксах, экспрессирующих MCM two, TBR 2D, c, X и dpi.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о трех вещах. Во-первых, использовать хорошо перфузированную и фиксированную ткань правильной толщины короны. Во-вторых, закрепить ткань на предметных стеклах и предотвратить их повреждение.

И, наконец, три, дающие достаточное время для кипячения и последующего охлаждения во время извлечения антигена. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как конфокальная реконструкция тканей и поведенческие эксперименты, чтобы ответить на дополнительные вопросы о том, как новорожденные нейроны могут интегрироваться в схему гиппокампа и способствовать когнитивной функции. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как проводить антиген ретривера на ткани гиппокампа, чтобы с большей эффективностью визуализировать презентативные типы клеток, которые дают начало новым нейронам во время других неврозов гиппокампа.