Экспресс-протокол для интеграции внехромосомных матриц с высокой скоростью передачи в геном C. elegans

Общая цель данной процедуры — интегрировать трансгенные внехромосомные массивы в геном serratus elegance с помощью ультрафиолетового облучения. Сначала выберите трансгенную линию с максимально возможным уровнем передачи, в идеале более 80%. Затем подвергните воздействию УФ-излучения выбранных трансгенных личинок на стадии L4, отобрав по четыре флуоресцирующих трансгенных особи F2 с каждой выбранной чашки F1. Далее проведите скрининг чашек F2 на наличие 100% флуоресцирующих трансгенных особей.

Поколение F3 червей. В конечном итоге отбор флуоресцентных животных поколения F3 может продемонстрировать 100% наследование трансгена. Данный экспериментальный подход хорошо подходит для трансгенных линий, которые с высокой частотой передают дополнительные хромосомные массивы.

Процедуру продемонстрирует Стефани Белман, техник нашей лаборатории. Начните с 500 больших чашек Петри, содержащих среду для выращивания нематод. Посейте на каждую чашку 0,3 milliliters насыщенного раствора isia coli.

Культура OP 50. Оцените эффективность передачи трансгена для каждой трансгенной линии, подлежащей интеграции. Используя флуоресцентный стереомикроскоп, перенесите 10 взрослых флуоресцирующих особей на 10 отдельные чашки с культуральной средой.

Животных помещают в инкубатор для червей, установленный при температуре, допускающей размножение данной генетической линии. Ежедневно контролируют потомство, чтобы определить, на какой стадии развития экспрессируется маркер ко-инъекции и когда он лучше всего визуализируется с помощью флуоресцентной микроскопии. Оценивают частоту передачи признака в потомстве, определяя процент флуоресцирующих особей.

Для интеграции трансгена выберите трансгенную линию с самым высоким коэффициентом наследования. Подготовьте популяцию трансгенных животных, синхронизированных по четвертой личиночной стадии (L4). Для интеграции перенесите 30 флуоресцентных взрослых особей GRA на пять культуральных чашек.

После того как черви откладывали яйца в течение трех-четырех часов при 15 °C, проверьте наличие не менее 30 яиц на чашке, затем удалите взрослых особей с чашек и культивируйте животных в инкубаторе для червей до достижения потомством четвертой личиночной стадии (L4). Поместите каждую чашку, содержащую 15–20 флуоресцентных трансгенных животных стадии L4, в УФ-кросслинкер без крышек, облучите червей, после чего перенесите их для восстановления. Инкубируйте облученных червей в течение ночи при 15 °C.

Подсчитайте количество выживших особей. Для эффективного облучения оптимальной считается выживаемость на уровне 80–90%. Содержите облученных животных при температуре от 15 до 25 °C до тех пор, пока потомство не достигнет стадии развития, позволяющей наблюдать экспрессию маркера ко-инъекции.

Перенесите одиночных флуоресцентных животных F1 на отдельные культуральные чашки. Содержите эти чашки F1 при температуре от 15 до 25 °C до тех пор, пока потомство не достигнет стадии, подходящей для наблюдения за флуоресцентными животными F2, в зависимости от используемого комаркера. В данном конкретном случае мы наблюдали за червями во взрослом состоянии; все чашки F1 были утилизированы, если на них наблюдалось либо одно: отсутствие потомства, что указывало на стерильность или гибель животного F1, либо два: отсутствие или наличие лишь немногих флуоресцентных животных F2, что указывало на то, что животное F1 не передало трансген с ожидаемой частотой.

Отберите по четыре флуоресцентных трансгенных животных поколения F2 с каждой выбранной чашки F1. При использовании флуоресцентных трансгенов выбирайте червей F2 с высоким уровнем флуоресценции, так как это может указывать на гомозиготность данных животных по интегрированному массиву. Обратите внимание, что при отборе животных F2 крайне важно не захватить яйца или личинки, чтобы избежать ложноотрицательных результатов на следующем этапе.

После выращивания животных поколения F2 проведите скрининг чашек с F2 на наличие 100% флуоресцентных трансгенных червей поколения F3. Скрининг проходит довольно быстро, так как наличие даже одного нефлуоресцентного червя означает, что чашку следует утилизировать; отберите восемь флуоресцентных особей F3 с выбранных чашек, чтобы подтвердить 100% наследование трансгена. По возможности сохраните несколько независимых интегрированных трансгенных линий.

Были проведены интеграции трансгенов в двух различных линиях, передающих внехромосомные массивы с примерно одинаковой частотой. При сравнении стандартного и усовершенствованного протоколов было установлено, что в усовершенствованном протоколе оптимизированы время и количество чашек, необходимых для каждой интегрированной линии. Затем мы проверили гипотезу о том, что более высокая скорость передачи трансгена в неинтегрированной линии облегчает интеграцию трансгена в геном.

Один конкретный трансген был интегрирован в линии с разной частотой передачи с использованием улучшенного протокола для линии с наивысшим показателем передачи. Три интегрированные линии были получены всего из 90 отобранных животных F1, в то время как для трансгенной линии с частотой передачи от 50 до 60% была получена одна интегрированная линия из 110 отобранных животных F1. После выполнения этой процедуры можно применить различные методы для поиска ответов на дополнительные вопросы, такие как определение экспрессии гена, паттерна и регуляции, локализации белка и оверэкспрессии белка или разработка субклеточных маркеров.