Экспресс-протокол для интеграции внехромосомных матриц с высокой скоростью передачи в геном C. elegans

Общая цель этой процедуры заключается в интеграции трансгенных экстрахромосомных матриц в геном serratus elegance с использованием ультрафиолетового излучения. Сначала выберите трансгенную линию с максимально возможной скоростью передачи, в идеале более 80%, затем облучите УФ-излучением выбранные трансгенные L, четыре личинки выделяют четыре из флуоресцентных трансгенных F, двух животных из каждой выбранной пластины F1. Следующий экран, два планшета F для 100% флуоресцентного трансгена.

F три червя. В конечном счете, выбор флуоресцентных животных поколения F 3 может показать 100% наследование трансгена. Этот экспериментальный подход хорошо подходит для трансгенных линий, которые передают дополнительные хромосомные массивы с высокой скоростью.

Демонстрировать процедуру будет Стефани Бельман, техник из нашей лаборатории. Начните с 500 больших чашек Петри, содержащих нематоду. Срединно засейте каждую пластину 0,3 миллилитрами насыщенной кишечной палочки.

Культура ОП 50. Оцените скорость передачи трансгенной линии, которая должна быть интегрирована для каждой трансгенной линии. Выберите 10 взрослых с флуоресцентной гравитацией на 10 отдельных культуральных планшетах под культурой флуоресцентного стереоскопа.

Животных в червячном инкубаторе устанавливают при температуре, позволяющей воспроизводству генетического фона. Наблюдайте за потомством каждый день, чтобы оценить, на какой стадии развития маркер коинъекции экспрессируется и лучше всего может наблюдаться с помощью флуоресцентной оскопии. Оцените скорость передачи потомства, определив процент флуоресцентного потомства.

Для интеграции трансгена выберите трансгенную линию с самой высокой скоростью передачи. Получить популяцию трансгенных животных, синхронизированных на стадии личинки L 4. Для интеграции выберите 30 взрослых флуоресцентных GRA на пяти культуральных планшетах.

После того, как черви отложили яйца в течение трех-четырех часов при температуре 15 градусов Цельсия, проверьте наличие не менее 30 яиц в тарелке, а затем исключите взрослых особей из тарелок и выращивайте животных в инкубаторе для червей до тех пор, пока потомство не достигнет стадии личинок L. Поместите каждую пластину, содержащую от 15 до 20 флуоресцентных трансгенных L четырех животных, в УФ-сшиватель со снятыми крышками, облучите червей для восстановления. Инкубируйте облученных червей в течение ночи при температуре 15 градусов Цельсия.

Проверьте количество животных, которые живы в наших руках. Выживаемость составляет от 80 до 90% для эффективного облучения. Выращивайте облученных животных при температуре от 15 до 25 градусов Цельсия до тех пор, пока потомство не достигнет стадии развития, что позволит наблюдать за экспрессией маркера коинъекции.

Перенесите отдельных флуоресцентных животных F1 на отдельные планшеты для культивирования. Держите эти пластины F1 при температуре от 15 до 25 градусов Цельсия до тех пор, пока потомство не достигнет подходящей стадии для наблюдения за флуоресцентным F-2 животными в зависимости от используемого сомаркера. В этом конкретном случае мы наблюдали, как взрослые черви отбрасывали все пластины F1, на которых было либо одно, либо не было потомства, что указывало на то, что животное F1 было стерильным или умерло, либо два нет, или только несколько флуоресцентных F-двух животных, указывающих на то, что животное F1 не передавало трансген с ожидаемой скоростью.

Выделите четыре флуоресцентных трансгенных F-двух животных из каждой выбранной пластины F1. При использовании флуоресцентных трансгенов выбирайте F двух червей с высоким уровнем флуоресценции, так как это может указывать на то, что эти животные гомозиготны для интегрированного массива. Обратите внимание, что при отборе F двух животных крайне важно не брать с собой яйца или личинки, чтобы избежать ложноотрицательных результатов на следующем этапе.

После выращивания F two животные проверяют F two планшеты на наличие 100% флуоресцентных трансгенных F трех червей. Скрининг происходит довольно быстро, так как присутствие одного нефлуоресцентного червя указывает на то, что пластину следует выбросить, выделить восемь флуоресцентных F трех животных из выбранных пластин, чтобы подтвердить 100% наследование трансгена. По возможности сохраняйте несколько независимых интегрированных трансгенных штаммов.

Были проведены интеграции трансгенов в двух разных линиях, передающих дополнительные хромосомные массивы примерно с одинаковой частотой. Используя стандартный и улучшенный протоколы, время и количество пластин, необходимых для каждой интегрированной линии, оптимизируются в улучшенном протоколе. Затем мы проверили гипотезу о том, что более высокая скорость передачи трансгена в неинтегрированной линии облегчает интеграцию трансгена в геном.

Один конкретный трансген был интегрирован в линии, передающие с разной скоростью, с использованием усовершенствованного протокола для самой высокой передающей линии. Три интегральные линии были выделены только у 90 отобранных животных F1, в то время как для трансгенной линии, передающей от 50 до 60%, была восстановлена одна интегральная линия от 110 отобранных животных F1. После этой процедуры могут быть применены различные методы, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как определение экспрессии генов, паттерна и регуляции, локализации белка и сверхэкспрессии белка или развитие субклеточных маркеров.