Определение конкретных сенсорных нейронов населения для изучения выразил ионных каналов

Общей целью этой процедуры является идентификация афферентных нейронов с помощью ретроградного мечения красителем и изучение ионных каналов в этих нейронах с помощью электрофизиологии и иммунохимии. Это достигается путем введения DAI в ткань-мишень для маркировки иннервирующих афферентных нейронов. Второй шаг заключается в выделении афферентных нейронов из ганглиев дорсальных корешков.

Затем меченые нейроны зажимаются для записи закрытых ионных каналов, последним шагом является идентификация экспрессированных ионных каналов в меченых нейронах с помощью иммунохимии. В конечном счете, используя комбинацию пластыря, зажима и иммунохимии, мы можем идентифицировать характер экспрессии, а также функциональные свойства ионных каналов в афферентных нейронах. Основное преимущество этого метода перед другими существующими методами заключается в том, что это неинвазивный метод, и DAI, который мы используем, DAI I известен своим быстрым поглощением нейронными окончаниями.

Отсутствие переноса между нейронами и долговременные удержания внутри нейронов, которые мы вводим. Демонстрировать процедуру будем я и Стефани, техник-исследователь из нашей лаборатории для инъекций красителя. Сначала сбрейте шерсть в области икры на обеих ногах крысы, находящейся под наркозом, с помощью электрической бритвы.

Затем наполните стерильный шприц One CC 200 микролитрами 1,5%-ного раствора Dai. Медленно введите иглу параллельно длинной оси каждой желудочно-кишечной мышцы и введите 100 микролитров дай в мышцу перед тем, как извлечь иглу из мышцы. Потяните поршень шприца назад, чтобы краситель больше не стекал с кончика.

Подождите 10 секунд, а затем извлеките иглу из мышцы. Четыре-пять дней необходимы для распределения красителя и подготовки к вскрытию. Поставьте на лед стакан с 10 миллилитровыми HBSS, 35-миллиметровую чашку Петри и 100-миллиметровую чашку Петри.

Далее взвесьте семь миллиграммов коллагеназы, один миллиграмм ДНК и 10 миллиграммов трипсина, предварительно разогрейте на водяной бане до 37 градусов Цельсия и прогрейте в ванне 15-миллилитровую центрифугу, содержащую 10 миллилитров EBSS. После усыпления крысы перед вскрытием быстро разрежьте кожу на спине животного. Затем удалите соединительную и мышечную ткань вдоль позвоночного столба для лучшего воздействия.

Впоследствии удалите поясничный отдел позвоночного столба. Далее поместите изолированный позвоночный столб в 100-миллиметровую чашку Петри. Нанесите охлажденный раствор HBSS с помощью стерильной пастбищной пипетки, чтобы препарат оставался влажным и холодным.

Разрежьте мышцы с боков позвоночного столба. Выполните дорсальную ламинэктомию, аккуратно удалив кость с помощью ронжеров или ножниц и закрыв углубления, содержащие ганглии дорсальных корешков. Неоднократно. Во время этой процедуры нанесите ледяной HBSS.

Под микроскопом изолируйте DRG, разрезав периферические и центральные нервы, оставив один-два миллиметра нерва для облегчения работы с ганглиями. Затем поместите изолированную DRG в 35-миллиметровую чашку Петри, содержащую ледяной буфер HBSS. Повторяйте процедуры до тех пор, пока все L четыре и L пять DRG не будут изолированы.

Удалите лишние нервы и кровеносные сосуды с помощью микроножниц и щипцов. Разрежьте DRG для лучшего воздействия ферментов, но не снимайте DRG с оболочки для диссоциации нейронов DRG. Добавьте ферменты в теплый фильтрующий материал EBSS, затем растворите в вихре и простерилизуйте фильтром.

Далее поместите все DRG в ферментный раствор со стерильной головкой пастбищной трубы. После этого наполните колбу 95% кислородом и 5% CO2 в течение 60 секунд, прежде чем плотно закрыть колбу. Затем инкубируйте колбу на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 60 минут при 240 оборотах в минуту.

По окончанию инкубации энергично. Встряхните колбу 50 раз, чтобы диссоциировать ДРГ в стерильных условиях. Добавьте в колбу пять миллилитров MEM plus, чтобы остановить ферментативную активность.

Переложите содержимое колбы в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте при 16-кратном перегрузке в течение шести минут. После этого удалите надосадочную жидкость и выбросьте ее. Добавьте пять миллилитров MEM plus в образец и аккуратно тритратьте с помощью пипетки.

Чтобы прервать этап центрифугирования с помощью гранул, удалите и выбросьте надосадочную жидкость и добавьте 500 микролитров MEM плюс аккуратно тритируйте с помощью одного миллилитра наконечника пипетки на пипетке, чтобы получить клеточную суспензию. После этого поместите покрытую полилизином стеклянную крышку в пустую, стерильную 35-миллиметровую посуду. Затем добавьте каплю клеточного суспензии к центру покровного стекла.

Повторяйте эту процедуру до тех пор, пока клеточный раствор не закончится. Поместите 35-миллиметровые чашки в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и 5% CO2 на один час, чтобы через час нейроны могли прилипнуть к крышке. Добавьте еще два миллилитра среды в каждую чашку и верните их в инкубатор для выполнения записи с помощью патч-хомута.

Во-первых, определите помеченные красителем нейроны DRG с помощью микроскопа с эпифлуоресценцией. Далее заполните стеклянный электрод внутренним раствором. Осторожно постучите, чтобы удалить все захваченные пузырьки.

Затем поместите электрод в держатель электрода. Опустите электрод к ячейке с помощью микроманипулятора. Как только электрод соприкоснется с ячейкой, приложите мягкое всасывание через всасывающую трубку до тех пор, пока не образуется плотное уплотнение.

Затем зажмите напряжение мембраны на нужном удерживающем потенциале. Получите конфигурацию зажима для всей ячейки за счет применения более сильного отсасывания. Чтобы удалить мембранный пластырь на кончике электрода, после того, как будет установлена конфигурация зажима для всей ячейки, начните запись.

При этой процедуре зафиксируйте нейроны на покровных листочках с помощью 4%-ного параформальдегида на один час. Затем пронзайте нейроны 2% tween 20 в PBS в течение 10 минут. Далее инкубируйте клетки в блокирующем растворе в течение одного часа.

Тестовые клетки инкубируются в блокирующем растворе плюс первичное антитело в течение ночи. Контрольный набор нейронов оставляют инкубировать в течение ночи в блокирующем растворе без каких-либо первичных антител. На следующий день промойте покровные листы буфером PBS три раза по пять минут каждый, а затем два промывки по пять минут каждая с 1% 20 для удаления несвязанного первичного антитела.

Затем инкубируйте тест и контролируйте покровные стекла с помощью соответствующего флуоресцентного меченного вторичного антитела в течение 30 минут, которое связывается с первичным антителом для обеспечения визуализации. После этого промойте покровные стекла PB S3 раза по пять минут каждый, чтобы удалить излишки вторичного антитела. Далее закрепите защитные стекла на чистом предметном стекле с помощью монтажного материала.

Затем нанесите прозрачный лак для ногтей на край покровного листика, чтобы зафиксировать его на месте. После высыхания визуализируйте нейроны и сделайте снимки с помощью программного обеспечения, прилагаемого к флуоресцентному микроскопу. Это представление инъекции Dai в желудочно-кишечную мышцу и ретроградной транспортировки из мышцы в DRG.

Здесь обозначены ДРГ L four и L five. Афферентные нейроны показаны на изображении яркого поля, а на этом флуоресцентном изображении показан один меченый красителем мышечный афферентный нейрон. Эта гистограмма показывает интенсивность флуоресценции сенсорных нейронов DII.

Большой пик принадлежит немеченным нейронам и снабжен уравнением Гаусса для определения средней интенсивности и стандартного отклонения. Пунктирная вертикальная линия представляет пороговое значение для маркировки DAI. Гистограмма содержит данные от 1047 нейронов, 167 из которых помечены dai.

Здесь находится репрезентативный мышечный афферентный нейрон с хорошим контролем напряжения мембраны. Натриевые токи при минус 20, минус 10 и ноль милливольт показаны слева, а соотношение токовых напряжений — справа. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о быстром, но осторожном удалении DRG и многократном увлажнении препарата при ледяном коде hbss.

После этой процедуры другие эфферентные нейроны могут быть помечены и идентифицированы, чтобы понять их роль в физиологии.