Подготовка первичных нейронов для визуализации нейриты в Frozen-гидратной государства Использование крио-электронной томографии

Чтобы сохранить нейрональные процессы ультраструктурным анализа, мы опишем протокол для обшивки первичных нейронов по электронной микроскопии сеток с последующей флэш замораживания, получая образцы взвешенных в слое стекловидного льда. Эти образцы могут быть рассмотрены с крио-электронного микроскопа для визуализации структуры в нанометровом масштабе.

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы вырастить первичные нейроны крыс таким образом, чтобы их нейроны были пригодны для визуализации с помощью криоэлектронной микроскопии. Это достигается путем предварительного приготовления блюд с ЭМ-решетками для гальванизации первичных нейронов. Второй шаг заключается в подготовке и размещении первичных нейронов на электромагнитных решетках.

Далее проводится витрификация нейронов на ЭМ-решетках. Заключительным этапом является сбор изображений с помощью криоэлектронной микроскопии с последующей последующей обработкой и аннотацией. В конечном счете, криоэлектронная микроскопия и томография используются для отображения ультраструктуры нейритов в замороженном гидратированном состоянии.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами заключается в том, что она может быть использована для 3D-визуализации замороженных гидратированных нейритов с нанометровым разрешением без использования химических фиксаторов. Таким образом, облегчается оценка морфологических характеристик, которые ближе к нативному состоянию. Начните эту процедуру с изучения целостности святого углерода на золотых электромагнитных решетках.

Используя световой микроскоп с увеличением не менее 25 раз, убедитесь, что угольные отверстия не повреждены более чем на 98%. Для покрытия первичных нейронов используйте горелку Бунзена, чтобы стерилизовать пламенем электромагнитные решетки и одновременно сделать их гидрофильными. Сразу же перенесите сетку карбоновой стороной вверх к центру стекла.

Нижняя посуда, поставьте по одной ЭМ-решетке на каждую посуду и используйте только предварительно простерилизованную стеклянную посуду. Затем с помощью светового микроскопа проверьте целостность решетки, сохраняя при этом ЭМ-сетку внутри стеклянного дна чашки для культуры тканей, нанесите 250 микролитров соответствующего лакирующего вещества на центральную стеклянную область чашки Петри. Медленно и осторожно убедитесь, что соответствующее покрытие покрывает всю сетку E EM.

После этого накройте чашку Петри крышкой и выдержите экземпляры в течение часа при комнатной температуре. Далее аспирируйте всю смесь полиоллизина из посуды с помощью стерильного наконечника пипетки, прикрепленного к вакуумной трубке в вытяжке. Избегайте прямого контакта с электромагнитной решеткой.

Затем с помощью дозатора с регулируемым вытеснением осторожно нанесите 250 микролитров стерильного PBS, чтобы полностью покрыть ЭМ-решетку в центральной области стекла каждой чашки Петри. Затем отсасывайте PBS из каждого блюда. После этого повторите процедуру три раза.

Дайте посуде с ЭМ-решетками высохнуть в вытяжке для культуры тканей в течение 15 минут. Проверка под световым микроскопом. Убедитесь, что они полностью сухие и в сетке нет пузырьков влаги.

В противном случае осторожно аспирируйте рядом с электромагнитной сеткой, чтобы устранить эту лишнюю влагу, сетку с покрытием следует немедленно использовать для покрытия нейронов. В этой процедуре рассчитайте подходящий объем клеток для каждого блюда, чтобы достичь концентрации 50 000 клеток на миллилитр на одно блюдо. Максимальное количество аппликационного материала должно составлять 250 микролитров, чтобы заполнить только центральную площадь стекла, а не всю посуду.

Затем инкубируйте чашки в течение 30 минут в CO2-инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы позволить клеткам восстановиться и прилипнуть через 30 минут. Медленно добавляйте 1,5 миллилитра подогретой клеточной среды в каждую чашку и избегайте прикосновения к электромагнитной сетке для нейронов гиппокампа. Смените носитель на следующий день, а затем меняйте половину носителя каждые два дня в течение 14 дней. В этой процедуре подготавливают оборудование и все материалы для заморозки и хранения золотых ЭМ сеток при криогенной температуре, которые включают в себя устройство для остекловывания с камерой влажности, фильтрующую бумагу без кальция, пару длинных плоских пинцетов, пару тонкоконечных специализированных пинцетов для витрификационной машины, дозатор жидкого азота, емкость с охлаждающей жидкостью и ящик для хранения электромагнитной решетки.

Далее включаем устройство остекловывания. Установите влажность на 100% и температуру на 32 градуса по Цельсию. В разделе опций установите время блока равным нулю секунд.

Это позволяет вручную промакивать через боковое окно камеры влажности. Затем сложите три фильтровальные бумаги без кальция. Разрежьте стопку на полоски шириной 0,5 сантиметра, которые после этого имеют длину около двух сантиметров, согните их под углом 90 градусов так, чтобы один участок бумаги был 0,5 сантиметра на 0,5 сантиметра.

Этот участок будет использоваться для промокания образца. Снимите среднюю бумагу и положите ее на другую фильтровальную бумагу, не содержащую кальция, до использования. Затем с помощью специализированной витрификации используйте пинцет, чтобы аккуратно отобрать ЭМ-решетку от чашки.

Обратите внимание на сторону электромагнитной решетки, на которой растут нейроны, так как положение будет иметь значение для следующего шага. Затем используйте черный скользящий замок на пинцете, чтобы надежно зафиксировать пинцет на электромагнитной сетке. Теперь вставьте пинцет в витрификационную машину таким образом, чтобы сторона электромагнитной сетки, на которой расположены нейроны, была обращена влево и в сторону от круглого отверстия со стороны витрификационной машины.

Затем втяните пинцет, который удерживает электромагнитную сетку, в машину для остекловывания. После этого поместите контейнер с охлаждающей жидкостью, заполненный достаточным количеством LN 2 и жидким этаном, в соответствующий держатель машины для остекловывания с помощью соответствующей команды экрана машины для остеклования. Поднимите камеру охлаждающей жидкости вверх до тех пор, пока она не будет промыта с дном камеры влажности с помощью пинцета с плоским концом.

Возьмитесь за один край фильтровальной бумаги так, чтобы более короткая сторона была перпендикулярна пинцету. Эта грань будет вступать в непосредственный контакт с ЭМ-сеткой для блоттинга. Теперь осторожно вставьте фильтровальную бумагу в боковое отверстие камеры влажности Устойчиво прижмите бумагу к электромагнитной сетке в течение 10 секунд, выбросьте бумагу и немедленно погрузите в воду.

Заморозьте образец в жидком этане с помощью автоматики витрификационной машины. После этого осторожно перенесите замороженную гидратированную ЭМ-решетку в одну из слотов в хранилище решетки. Это изображение с помощью светового микроскопа центральной области электромагнитной сетки с 10-кратным увеличением, на котором первичные нейроны крыс росли в течение двух недель.

Вот увеличенный вид аквабокса, где наблюдаются нейроны и их нейритные проекции. Это электронная микрофотография нейрита, проецирующаяся наружу из тела нейрона при увеличении 4K. Здесь вблизи виден синий прямоугольник, где при увеличении 20 К хорошо видны внутренние особенности нейритов.

В этом видео показана 3D-реконструированная стопка микрофотографий нейрита из первичной культуры нейронов гиппокампа крысы. Он визуализируется с помощью томографии и сопровождается соответствующей 3D-цветовой аннотацией. Вот еще одно видео, демонстрирующее 3D-реконструированную стопку изображений аксона ганглия дорсального корешка крысы, собранных с помощью криоэлектронной томографии, с последующей соответствующей 3D-цветовой аннотацией

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как подготовить первичные нейроны на сетках электронной микроскопии таким образом, чтобы это было пригодно для визуализации их нейронов в замороженном гидратированном состоянии с помощью криоэлектронной томографии.