Name: МикроРНК В месте Гибридизация на формалин ткани почки (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-30T19:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Изучите метод in situ гибридизации для обнаружения микроРНК в формалин-фиксированных тканях почки. Этот протокол позволяет локализовать и количественно оценить экспрессию микроРНК в различных сегментах нефрона.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Эта работа была поддержана американскими Национальными Институтами Здоровья предоставляет HL082798 и HL111580.

1. Почечной ткани Разделы <ol><li> Зафиксированные в формалине (10%) разделы почек парафин нарезают на предметных стеклах при толщине 5 мм с использованием Microm HM 355 S. Слайды можно хранить в течение нескольких месяцев анализа. </li></ol> 2. Подготовка решения <ol><li> Подготовить 1 л 1x PBS в DDH 2 O в автоклавируемый верхней бутылки винта. Заполните другую бутылку 1 л DDH 2 O. Добавьте 1 мл DEPC каждому бутылки, крышки и энергично встряхивают. Пусть решения на ночь при комнатной температуре, чтобы разрушить РНКазы и затем автоклав. Добавить 400 мл Tween-20 в 1 л 1х PBS, чтобы сделать PBS-T. </li><li> Подготовка протеиназы K буфера (50 mMTris-HCl, рН 8,0 и 1 мМ CaCl 2 в DEPC-обработанной воде). </li><li> Готовят раствор 0,2% глицина в PBS-T. </li></ol> 3. Тканевый препарат <ol><li> Подготовка большой объем гибридизации буфера (50-100 мл), состоящий из 50% формамида, 5x SSC, 0,1% Tween, 9,2мМ лимонной кислоты для корректировки рН 6, 50 мкг / мл гепарина и 500 мкг / мл дрожжевой РНК в DEPC лечение DDH 2 O. Разделить на 1 мл аликвоты и хранят при температуре -80 ° С. </li><li> Удалить парафин из ткани путем промывки 3 раза в свежем ксилоле в течение 5 мин каждый. </li><li> Увлажняет срезах тканей на 5 мин инкубации в уменьшении концентрации этанола (100%, 75%, 50% и 25%) в DDH 2 O. </li><li> Лечить слайды с достаточно DEPC, чтобы полностью покрыть срезы ткани (примерно 0,4-0,5 мл) в течение 1 мин. Убедитесь ткани не высыхают. </li><li> Промойте скользит в DEPC лечить PBS-T дважды в течение 5 мин, собирая DEPC содержащих отходов для надлежащей утилизации. Все реагенты должны быть DEPC лечение для устранения РНКаз с этого момента. </li><li> Prewarm протеиназы К буфер и добавить протеиназы К до конечной концентрации 10 мкг / мл. Крышка срезах ткани протеиназой К раствору и инкубируют при 37 ° С в течение 5 мин. </li><li> Быстро удалить proteinasрешение для электронной К и добавить 0,2% глицин в PBS-T в течение 30 сек. </li><li> Промыть скользит в DEPC обрабатывали PBS-T дважды в течение 30 секунд каждый. </li><li> Fix разделы в свежеприготовленный 4% параформальдегида в течение 10 мин. </li></ol> 4. Гибридизация <ol><li> Добавить 50 мкл буфера для гибридизации (50% формамид, 5x SSC, 0,1% Tween, 9,2 мМ лимонной кислоты для корректировки рН 6, 50 мкг / мл гепарина, 500 мкг / мл дрожжевой РНК) на срез ткани и покрытие с РНКазы HybriSlips сократить просто больше, чем срезах тканей. </li><li> Prehybridize секции в контролируемой влажностью гибридизации печи в течение 2 ч при температуре гибридизации, определенной для «дигоксигенин меченым зондом 3 (обычно ДНК Tm зонда -21 ° С, (т.е. 54 ° C в течение микроРНК-382, ДНК-зонд Tm = 75 ° C ), с помощью ткани лабораторных салфетки, пропитанные 50% formamide/50% 5x SSC, чтобы держать камеру увлажняется. </li><li> Развести зонд микроРНК, положительный контроль (U6, небольшой ядерный РНК) и отрицательный контроль (яичницупоследовательность) до 40 нМ в гибридизации буфер (75 мкл буфера необходимо в каждой секции). </li><li> Нагреть зонда гибридизации в буфере при 65 ° С в течение 5 мин. </li><li> Удалить слайды из гибридизации духовке и удалить покровные и избыточный буфер гибридизации с Предгибридизацию. </li><li> Добавить 75 мкл зонда, содержащего буфера на срез ткани, непосредственно в ткани. Обложка ткани с HybriSlips просто достаточно большой, чтобы покрыть срезы ткани. </li><li> Ведение слайд уровень держатель, вернуться к гибридизации духовке в течение инкубации в течение ночи при температуре от шага 4.2 (примерно 16 ч). </li></ol> 5. Строгость Вымойте <ol><li> Добавить 200 мкл 2x SSC, с подогревом до температуры гибридизации, как раз под одного края покровные, чтобы помочь освободить покровное из ткани. Удалить покровное, наклоняя слайд. </li><li> Промыть слайды в 200 мкл 50% формамида, 50% 2х SSC при 3x температуры гибридизации в течение 30 мин каждый. </li><li> Прополоскатьслайды 5x в PBS-T при комнатной температуре в течение 5 мин каждый на орбитальном шейкере на низкой скорости. </li></ol> 6. Обнаружение <ol><li> Инкубировать слайд в блокирующем буфере (2% козьей сыворотки лошади или, 2 мг / мл BSA в PBS-T) в течение 1 часа при комнатной температуре на ротационном шейкере на низкой скорости. </li><li> Развести анти-DIG-AP Fab фрагменты в блокирующем буфере 1:100. Добавить 100 мкл на срез ткани и накрыть HybriSlips сократить достаточно большой, чтобы покрыть срезы. </li><li> Инкубируйте антитело в увлажненной камере при 4 ° С в течение ночи (около 16 ч). </li><li> Вымойте слайдов в PBS-T 7x, в течение 5 мин каждый на круговой качалке при низкой скорости. </li><li> Промыть слайдов в AP буфера (100 мМ TrisHCl рН 9,5, 50 мМ MgCl 2, 100 мМ NaCl, 0,1% Tween 20) 3x, в течение 5 мин каждый. </li><li> Добавить решение НБТ / BCIP А.П. буфера (200 мкл/10 буфер мл) </li><li> Добавить 400-500 мл разведенного раствора НБТ / BCIP к каждому слайду, чтобы полностью покрыть все срезах тканей. Разработать в темном, уровня, увлажнительIED камера для 4-5 часов. </li></ol> 7. Монтажные Слайды <ol><li> Высушить секции в возрастающих концентраций этаноле (25%, 50%, 75%, 100%) в течение 5 мин каждый. </li><li> Выдержите в ксилола 5x, чтобы очистить разделы. </li><li> Гора скользит в предметный столик Permount монтажа средних и сухой в течение ночи. </li></ol>

<ol><li>Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicer+regulates+thedevelopment+of+nephrogenic+and+ureteric+compartments+in+the+mammalian+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney.</a> Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).</li>
<li>Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pro-apoptotic+protein+Bim+is+a+MicroRNA+target+in+kidney+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Neph%22%5BJournal%5D)">The pro-apoptotic protein Bim is a MicroRNA target in kidney progenitors.</a> J. Am. Soc. Neph. 22 (6), 1053-1063 (2011).</li>
<li>Tian, Z., Greene, A. S., Pietrusz, J. L., Matus, I. R., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-target+pairs+in+the+rat+kidney+identified+by+microRNA+microarray%2C+proteomic%2C+and+bioinformaticanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-target pairs in the rat kidney identified by microRNA microarray, proteomic, and bioinformaticanalysis.</a> Genome Res. 18 (3), 404-411 (2008).</li>
<li>Mladinov, D., Liu, Y., Mattson, D. L., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+contribute+to+the+maintenance+of+cell-type-specific+physiological+characteristics%3A+miR-192+targets+Na%2B%2FK%2B-ATPase+%CE%B21%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs contribute to the maintenance of cell-type-specific physiological characteristics: miR-192 targets Na+/K+-ATPase β1.</a> Nucleic Acids Res. 41 (2), 1273-1283 (2013).</li>
<li>Liu, Y., Taylor, N. E., Lu, L., Usa, K., Cowley, A. W., Ferreri, N. R., Yeo, N. C., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+medullary+microRNAs+in+Dahl+salt-sensitive+rats%3A+miR-29b+regulates+several+collagens+and+related+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Renal medullary microRNAs in Dahl salt-sensitive rats: miR-29b regulates several collagens and related genes.</a> Hypertension. 55 (4), 974-982 (2010).</li>
<li>Kato, M., Zhang, J., Wang, M., Lanting, L., Yuan, H., Rossi, J. J., Natarajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-192+in+diabetic+kidney+glomeruliand+its+function+in+TGF-b-induced+collagen+expression+via+inhibition+of+E-box+repressors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruliand its function in TGF-b-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (4), 3432-3437 (2007).</li>
<li>Krupa, A., Jenkins, R., Luo, D. D., Lewis, A., Phillips, A., Fraser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+microRNA-192+promotes+fibrogenesis+in+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Neph%22%5BJournal%5D)">Loss of microRNA-192 promotes fibrogenesis in diabetic nephropathy.</a> J. Am. Soc. Neph. 21 (3), 438-447 (2010).</li>
<li>Wang, B., Herman-Edelstein, M., Koh, P., Burns, W., Jandeleit-Dahm, K., Watson, A., Saleem, M., Goodall, G. J., Twigg, S. M., Cooper, M. E., Kantharidis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+expression+is+regulated+by+miR-192%2F215+by+a+mechanism+that+is+independent+of+the+profibrotic+effects+of+transforming+growth+factor-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">E-cadherin expression is regulated by miR-192/215 by a mechanism that is independent of the profibrotic effects of transforming growth factor-β.</a> Diabetes. 59 (7), 1794-1802 (2010).</li>
<li>Kato, M., Arce, L., Wang, M., Putta, S., Lanting, L., Natarajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microRNA+circuit+mediates+transforming+growth+factor-%CE%B21+autoregulation+in+renal+glomerular+mesangial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">A microRNA circuit mediates transforming growth factor-β1 autoregulation in renal glomerular mesangial cells.</a> Kidney Int. 80 (4), 358-368 (2011).</li>
<li>Gottardo, F., Liu, C. G., Ferracin, M., Calin, G. A., Fassan, M., Bassi, P., Sevignani, C., Byrne, D., Negrini, M., Pagano, F., Gomella, L. G., Croce, C. M., Baffa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-RNA+profiling+in+kidney+and+bladder+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Urol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers.</a> Urol. Oncol. 25 (5), 387-392 (2007).</li>
<li>Juan, D., Alexe, G., Antes, T., Liu, H., Madabhushi, A., Delisi, C., Ganesan, S., Bhanot, G., Liou, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+microRNA+panel+for+clear-cell+kidney+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Urol%22%5BJournal%5D)">Identification of a microRNA panel for clear-cell kidney cancer.</a> Urol. 75 (4), 835-841 (2010).</li>
<li>Xu, X., Kriegel, A. J., Liu, Y., Usa, K., Mladinov, D., Liu, H., Fang, Y., Ding, X., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+ischemic+preconditioning+contributes+to+renal+protection+by+upregulation+of+miR-21%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Delayed ischemic preconditioning contributes to renal protection by upregulation of miR-21.</a> Kidney Int. 82 (11), 1167-1175 (2012).</li>
<li>Kriegel, A. J., Mladinov, D., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+study+of+microRNAs+and+its+application+in+kidney+disease+and+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Translational study of microRNAs and its application in kidney disease and hypertension.</a> 122 (10), 439-447 (2012).</li>
<li>Kloosterman, W. P., Wienholds, E., de Bruijn, E., Kauppinen, S., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+miRNAs+in+animal+embryos+using+LNA-moidified+oligonucleotide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA-moidified oligonucleotide probes.</a> Nat. Methods. 3 (1), 27-29 (2006).</li>
<li>Nelson, P. T., Baldwin, D. A., Kloosterman, W. P., Kauppinen, S., Plasterk, R. H., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAKE+and+LNA-ISH+reveal+microRNA+expression+and+localization+in+archival+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue.</a> RNA. 12 (2), 187-191 (2006).</li>
<li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).</li>
<li>Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-382+targeting+of+kallikrein+5+contributes+to+renal+inner+medullary+interstitial+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Genomics%22%5BJournal%5D)">MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis.</a> Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).</li>
</ol>

Там нет ничего, чтобы раскрыть.

Целью этой статьи было описать протокол для микроРНК в гибридизация, который хорошо работает в формалине тканей фиксированных в почках. При разработке этого протокола несколько важных источников окрашивания артефакта были определены. Пристальное внимание к этим вопросам может помочь избежать окрашивания артефакт и увеличить вероятность успешного ISH перспективе. Одним из наиболее можно избежать причин окрашивания артефакта может произойти, когда срезах ткани становятся сушат в течен...

МикроРНК небольшие (длиной около 22 нуклеотидов) некодирующих РНК, которые эндогенно производится. Как правило, они функционируют для подавления экспрессии белка через репрессии трансляции или деградации мРНК. микроРНК связываются с мРНК мишеней с неполной комплементарности, что делает возможным для одного микроРНК для подавления несколько целей. Понимание того, какие типы и структуры клеток выразить микроРНК является важной частью понимания механизмов, через которые изменения в микроРНК выражение влияния клеток, тканей фенотипов. Хотя методы, такие как микроРНК последовательности, количественной ПЦР, Нозерн блоттинг может быть использован для обнаружения микроРНК в целом тканей, этот подход не позволяет определить, какой конкретный тип клеток они пришли в данной ткани. Рассечение клеточных и структурных компонентов до анализа с использованием этих методов может быть очень трудно и условия, необходимые для достижения адекватных обособления может привести к альterations в экспрессии или деградации РНК гена. микроРНК в гибридизация является метод, используемый для визуализации местоположения микроРНК и уровни экспрессии в тканях. Этот метод особенно ценен в тканях, состоящих из разнородных структур, таких как почки. Микро РНК, как было показано играют регуляторную роль в 2,3 развития почек и физиологии 4. экспрессии микроРНК изменения, также было показано, участвуют с почечной патологией, таких как фиброз 5-10, диабетической нефропатии 7, почечной карциномы 11,12 и острой почечной 13. В нашем исследовании, мы обнаружили, что оптимизации микроРНК в гибридизация для тканей почек было ценным для определения точных структурных местоположения выражения микроРНК как в здоровье и болезни 14. Определение трубчатого и клеточной экспрессии различных микроРНК является важным, поскольку их регулирование таrgets может зависеть от клеточных функций. В пораженных государств важно также определить, как изменения в экспрессии микроРНК могут быть функции влияет. Цель метода, описанного здесь в том, чтобы построить на существующих методологий ISH разработанных Клоостерман др.. 15, другие исследователи 16,17, а те, предложенный Exiqon 1 и оптимизировать метод формалином тканях фиксированных в почках. Мы успешно использовали этот метод для идентификации различных региональных различий в почечной выражения микроРНК микроРНК-382 с односторонним обструкции мочеточника 18. Этот подход может быть использован с другими тканями, а также с дополнительной оптимизации.

<table><tbody><tr><td>Параформальдегид</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>диэтил пирокарбонат</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Твин-20</td><td>Сигма</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Ксилолы</td><td>Сигма</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>этанол</td><td>ультра чистый</td><td>200CSPTP</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Life Технологии</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C2536</td><td></td></tr><tr><td>Глицин</td><td>J.T. Baker</td><td>4059-00</td><td></td></tr><tr><td>Лимонная кислота</td><td>Sigma</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>Формамид</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>15557-044</td><td></td></tr><tr><td>Гепарин</td><td>SAGENT</td><td>25021-400-30</td><td></td></tr><tr><td>Дрожжевая РНК</td><td>Life Technologies</td><td>AM7118</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266-1004</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>4058-01</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Fermentas</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>3' DIG- микроРНК-зонд</td><td>Exiqon</td><td>miR dependent-05</td><td></td></tr><tr><td>3' DIG- Скремблированный датчик miR</td><td>Exiqon</td><td>99004-05</td><td></td></tr><tr><td>3' DIG- U6 miR зонд</td><td>Exiqon</td><td>99002-05</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-Ab Fab</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>Roche</td><td>11681451001</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher</td><td>Fit to tissue size</td><td></td></tr><tr><td>Microtom HM 355 S</td><td>Thermo Scientific</td><td>23-900-672</td><td></td></tr><tr><td>Выдвижная гибридизационная печь</td><td>Boekel</td><td>241000</td><td></td></tr><tr><td>Алюминиевый противень в сборе</td><td>Boekel</td><td>C2403973</td><td></td></tr><tr><td>Решетка из нержавеющей стали</td><td>Boekel</td><td>C2403754</td><td></td></tr></tbody></table>

МикроРНК<em&gt; В месте</em&gt; Гибридизация на формалин ткани почки

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

В этой статье мы опишем метод колориметрического обнаружения микроРНК в почках через в гибридизация с дигоксигенином отмеченных микроРНК зондов. Этот протокол, первоначально разработанная Клостермана и коллег для обширного использования с Exiqon микроРНК зондов 1, был изменен, чтобы преодолеть проблемы, присущие анализа микроРНК в тканях почек. К ним относятся такие вопросы, как определение структуры и трудно удалить остаточный зонд и антитела. Использование относительно тонкий, толщиной 5 мм, срезы ткани позволили четкой визуализации структур почек, в то время как сильный сигнал зонда был сохранен в клетках. Кроме того, концентрация зонда и условия инкубации были оптимизированы для облегчения визуализации микроРНК выражения с низким фоном и неспецифической сигнала. Здесь, оптимизированный протокол описан, охватывающий первоначальный сбор тканей и подготовку через монтажа слайдов в конце процедуры. Основная ComponeNTS этого протокола могут быть изменены для применения в других тканях и моделей клеточных культур.

Области раздела тканей, которые становятся высохли в течение гибридизации, инкубации или мыть шаги обычно в конечном итоге окрашивания темнее при разработке НБТ / BCIP. Рисунок 1 показывает часть секции почек, в которых HybriSlip соскользнул из краю ткань, что позволяет ему стать частично обезвожен. Несмотря регидратации и область покрытия для оставшихся шагов, сигнал в обезвоженной части является искусственно завышены. Важность управления время разработки NBT-BCIP продемонс...

В этой статье описывается в протокол гибридизация оптимизированный для колориметрического обнаружения микроРНК выражения в формалине секциях фиксированных в почках.

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Общая цель следующего эксперимента заключается в локализации и количественном определении экспрессии микроРНК в тканях почек. Это достигается путем предварительной гибридизации меченого дигогенином зонда с определенной микроРНК в ткани почки. На втором этапе ткань инкубируют с антителом к дигогенину, конъюгированным с щелочной фосфатазой.Затем к ткани добавляют субстрат N-B-T-B-C-I-P для визуализации локализации микроРНК путем образования продукта синего цвета в местах гибридизации зондов к микроРНК; в результате определяются области почек и сегменты нефронов, в которых экспрессируются микроРНК, на основании гибридизации комплементарных зондов к микроРНК. В данной процедуре используются формалиново-фиксированные парафиновые срезы почек толщиной 5 мкм, нанесенные на предметные стекла. Для подготовки срезов почек к анализу сначала удаляют парафин из ткани путем трехкратного промывания в свежем ксилоле по 5 минут.Регидратируйте срезы тканей путем пятиминутной инкубации в растворах этанола с убывающей концентрацией в дважды дистиллированной воде. Затем обработайте стекла достаточным количеством dathyl, перкарбоната или desy, чтобы полностью покрыть срезы тканей, и выдержите в течение одной минуты. Следите за тем, чтобы ткани не пересыхали.Извлеките предметные стекла из эксикатора и промойте их. Промойте стекла в растворе PBST дважды по пять минут. Убедитесь, что содержимое эксикатора с отходами собрано для надлежащей утилизации.С этого момента все реагенты должны быть подвергнуты соответствующей обработке. Для элиминации РНК добавьте протеиназу K в предварительно нагретый буфер для протеиназы K до конечной концентрации 10 µg/mL. Покройте срезы ткани раствором протеиназы K и инкубируйте при 37 °C в течение пяти минут. Быстро удалите раствор протеиназы K и добавьте 0,2% глицина в PBST на 30 секунд.Промойте стекла в PBST, обработанном Desy, дважды по 30 секунд. В завершение зафиксируйте срезы тканей в свежеприготовленном 4% параформальдегиде в течение 10 минут.Для начала данной процедуры добавьте по 50 µL гибридизационного буфера на каждый срез ткани и накройте их свободными от РНК гибридизационными покровными стеклами, размер которых немного превышает размер срезов ткани. Поместите предметные стекла в увлажненную камеру с лабораторными салфетками, смоченными в растворе из 50% формамида и 50% 5X SSC. Проведите предварительную гибридизацию срезов ткани, выдержав увлажненную камеру в течение двух часов в термостате при температуре гибридизации, определенной для 3'-dig-оксигенированного меченого зонда. Температура гибридизации для зонда обычно соответствует температуре плавления ДНК (TM) зонда минус 21 °C.Например, температура гибридизации для зонда mere 3 82 составляет 54 °C, так как его TM равна 75 °C. Приготовьте зонд на микроРНК, а также положительный и отрицательный контроли, разведя каждый из них до концентрации 40 nM в буфере для гибридизации. В качестве положительного контроля используется малая ядерная РНК U6, в качестве отрицательного — скремблированная последовательность.Нагрейте зонд и контроли при 65 °C в течение пяти минут. Извлеките предметные стекла из печи для гибридизации. Удалите гибридные полоски и излишки буфера для гибридизации из установки для предварительной гибридизации.Нанесите по 75 µL зонда в буфере непосредственно на каждый срез ткани. Накройте гибридизационными покровными стеклами, размер которых должен быть чуть больше размера срезов ткани. Держите держатель для предметных стекол в горизонтальном положении.Поместите стекла обратно в печь для гибридизации при соответствующей температуре. Инкубируйте в течение ночи, примерно 16 часов. По завершении гибридизации извлеките стекла из печи для гибридизации.Добавьте 200 µL 2X SSC, нагретого до температуры гибридизации, непосредственно под один край покровного стекла, чтобы облегчить его отделение от ткани. Снимите покровное стекло, наклонив предметное стекло. После снятия покровных стекол трижды промойте предметные стекла в 200 µL раствора, состоящего из 50% формамида и 2X SSC, при установленной температуре гибридизации по 30 минут за каждую процедуру.Промойте предметные стекла пять раз в PBST при комнатной температуре по пять минут каждое на орбитальном шейкере на низкой скорости. Начните эту процедуру с инкубации стекол в блокирующем буфере в течение одного часа при комнатной температуре на орбитальном шейкере на низкой скорости. Через один час добавьте 100 µL анти-dig AP FAB фрагментов к каждому срезу ткани и накройте гибридными покровными стеклами.Отрежьте фрагмент достаточного размера, чтобы полностью покрыть срез. Инкубируйте предметные стекла во влажной камере при температуре 4 °C в течение ночи или примерно 16 часов на следующий день. Промойте стекла семь раз в растворе PBST при комнатной температуре по пять минут за каждую процедуру на орбитальном шейкере, установленном на низкую скорость.Затем трижды промойте предметные стекла в буфере AP по пять минут каждое. Приготовьте проявитель N-B-T-B-C-I-P, добавив 200 µL раствора N-B-T-B-C-I-P к 10 mL буфера AP. Нанесите от 400 до 500 µL разведенного раствора N-B-T-B-C-I-P на каждое предметное стекло, чтобы полностью покрыть все срезы ткани.Оставьте срезы в темной влажной камере при комнатной температуре на четыре-пять часов до завершения колориметрического детектирования. Обезводьте срезы, помещая их в растворы этанола возрастающей концентрации на пять минут в каждом, затем проведите просветление срезов путем пятикратной инкубации в ксилоле по пять минут за раз. В завершение зафиксируйте препараты на предметных стеклах с помощью среды для заключения PerMount и оставьте их для высыхания на ночь.Предотвращение высыхания среза ткани имеет решающее значение для успеха данного протокола гибридизации in situ. На левой части этого рисунка показан фрагмент среза почки, в котором гибридизационный предметное стекло соскользнуло с края ткани, что привело к ее частичной дегидратации. Несмотря на последующую регидратацию и покрытие на оставшихся этапах, сигнал в дегидратированной области искусственно завышен по сравнению с участком, который оставался покрытым гибридизационным стеклом.Калибровочная шкала на данном изображении соответствует 100 microns. Важность оптимизации продолжительности проявления N-B-T-B-C-I-P продемонстрирована на следующих рисунках. На панели A показано, что период проявления более четырех-пяти часов приводит к выраженному неспецифическому окрашиванию и размытому сигналу контрольного микроРНК-зонда в тканях по всей почке.На панели B показано, что инкубация продолжительностью более четырех-пяти часов не приводит к дальнейшему усилению сигнала при анализе почек на наличие высокоэкспрессируемых мишеней, таких как контрольная малая ядерная РНК U6. Эти данные, адаптированные из предыдущего исследования, подтверждают применимость данного метода гибридизации in situ для детекции микроРНК в тканях почек. На панели A представлены репрезентативные изображения экспрессии miR-382, полученные с помощью гибридизации in situ в срезах почек мышей с односторонней обструкцией мочеточника (UUO) или без неё, которые подвергались воздействию либо анти-miR-382, либо контрольного (scrambled) антисмыслового олигонуклеотида. UUO индуцировала повышение экспрессии miR-382, о чем свидетельствует более интенсивное окрашивание в ткани группы UUO + antis scrambled по сравнению с тканью группы sham + antis scrambled.Это увеличение было заблокировано обработкой анти-ME 3 82. Графики на панели B показывают экспрессию mere 3 82 у мышей группы ложного воздействия (sham), обработанных анти-scrambled, в процентах от средней интегральной оптической плотности. Согласно показателю интенсивности пикселей, UUO вызывает значительное увеличение экспрессии mere 3 82 во внешнем и внутреннем мозговом веществе, что блокируется анти-ME 3 82.Данное увеличение может быть визуализировано и измерено с помощью гибридизации microRNA in situ. Эти результаты также согласуются с данными qPCR, не представленными здесь, что указывает на то, что использование гибридизации in situ для обнаружения экспрессии miR-382 в формалином зафиксированной почке является достаточно чувствительным методом для получения количественных результатов, отражающих анализ экспрессии на основе qPCR. Кроме того, гибридизация in situ позволяет измерять отчетливые региональные различия в экспрессии microRNA внутри почки.

microrna-in-situ-hybridization-for-formalin-fixed-kidney-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Всего горы<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация E8.5 в E11.5 эмбрионов мыши

Здесь мы описываем эффективные высокой пропускной...

Высокая пропускная способность На месте Гибридизация метод для характеристики Шаблоны экспрессии мРНК в фетальных Мышь Нижняя урогенитального тракта

Здесь мы описываем упрощенный протокол для анализа экспрессии микроРНК (микроРНК) в архивных клинических тканях с фиксированным формалином, парафином (FFPE) или свежезамороженным раком предстательной железы (PCa) с использованием количественной ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР) и гибридизации in situ (ISH).

микроРНК экспрессии анализ рака предстательной железы Клинические тканей

Здесь мы представляем протокол для определения экспрессии микроРНК в образцах пациентов с раком молочной железы с использованием гибридизации микроРНК in situ.

Анализ клинико-патологическими микроРНК выражения при раке молочной железы ТКАНЕЙ с помощью микроРНК<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация

микро РНК (интерферирующим) являются короткие и очень гомологичных последовательности РНК, выступающей в качестве post-transcriptional регуляторы messenger РНК (мРНК). Текущие методы обнаружения Мирна различаются по чувствительности и специфичности. Мы описываем протокол, который сочетает в себе в situ Гибридизация и иммуноокрашивания для одновременного обнаружения Мирна и белковых молекул на разделах ткани сердца мыши.

Ткани конкретных Мирна выражение профилирования в мыши сердца с помощью секции гибридизации In Situ

Мы описываем протокол лазерного микропереписьа подсегментов человеческой почки, включая гломерул, проксимальные трубочку, толстую восходящую конечность, сбор протока и интерстиция. Затем РНК изолируются из полученных отсеков, и секвенирование РНК осуществляется для определения изменений в транскрипцио-подписи в каждом подразиме.

Применение лазерной микродиссеции для раскрытия региональной транскриптомики в тканях почек человека

В данной статье представлен протокол детектирования экспрессии микроРНК в почках мышиной модели с острым повреждением почек с использованием количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени. В этом протоколе особое внимание уделяется мышиной модели ишемического повреждения почек и тщательному извлечению образцов микроРНК.

Метод количественного определения микроРНК в почке мышиной модели с ишемическим повреждением почек

Мы описываем метод оценки экспрессии микроРНК в почках мышей с односторонней мочеизъемной обструкцией (UUO) по количественной обратной транскрипции полимеразной цепной реакции. Этот протокол подходит для изучения профилей экспрессии микроРНК почек у мышей с UUO и в контексте других патологических состояний.

Количественная оценка ПЦР в реальном времени микроРНК выражений в мышеловой почки с односторонним мочеборным препятствием

микроРНК участвуют в патогенезе IgA-нефропатии. Мы разработали надежный метод определения уровней экспрессии микроРНК в почках мышиной модели IgA-нефропатии (мыши HIGA). Этот новый метод облегчит проверку участия микроРНК в IgA-нефропатии.

Обнаружение экспрессии микроРНК в почках мышей-нефропатических иммуноглобулинов А

Здесь мы доставляем экзогенные искусственно синтезированные имитаторы микроРНК в почки посредством инъекции в хвостовую вену невирусного вектора и наночастиц полиэтиленимина в нескольких моделях мышей с заболеваниями почек. Это привело к значительной сверхэкспрессии мишени микроРНК в почках, что привело к ингибированию прогрессирования заболевания почек на нескольких моделях мышей.

Доставка экзогенной искусственно синтезированной мимической микроРНК в почку с использованием наночастиц полиэтиленимина в нескольких моделях мышей с заболеваниями почек

Протокол описывает метод тандемной иммунофлуоресцентной гибридизации с тканью, интегрированной в формалин-фиксированный парафин, для одновременного обнаружения и количественного определения микроРНК и мультиплексированных белков.

Амплификация и распознавание микроРНК с помощью гибридизации заблокированных нуклеиновых кислот in situ как новый метод обнаружения и количественной оценки

Изучите метод in situ гибридизации для обнаружения микроРНК в формалин-фиксированных тканях почки. Этот протокол позволяет локализовать и количественно оценить экспрессию микроРНК в различных сегментах нефрона.

МикроРНК

Больше видео