Культивирование и поддержка

Общая цель данной процедуры заключается в выделении C difficile из образцов фекалий для культивирования C difficile с целью приготовления глицериновых стоков для длительного хранения, а также подготовки и подсчета запасов спор для дальнейшего использования в различных целях. Это достигается путем первоначального выделения C difficile из образцов кала путем посева на селективную среду. Вторым этапом является выращивание C difficile в жидкой среде и поддержание долгосрочных стоков C difficile в глицерине.

Затем штамм C difficile извлекают из замороженных глицериновых стоков и высевают штрихом на чашки с агаром. На заключительном этапе, следуя данным протоколам, подготавливают и подсчитывают стоки спор C difficile. C difficile может быть выращен на различных средах для проверки и подтверждения его идентичности, а также для успешного культивирования и поддержания.

Эти глицериновые стоки и культуры могут быть в дальнейшем использованы в многочисленных последующих исследованиях, включая эксперименты на животных и дополнительные молекулярно-биологические исследования. Основным преимуществом использования виниловой анаэробной камеры для культивирования c difficile по сравнению с другими методами, такими как использование банок со свечой, является возможность поддержания строго анаэробной среды, что обеспечивает стабильный и надежный рост c difficile. Как правило, люди, которые только начинают осваивать эти методы, могут столкнуться с трудностями из-за ограниченной подвижности рук в перчатках внутри камеры, а также из-за необходимости тщательного предварительного планирования экспериментов.

Эти процедуры продемонстрирует лаборант из моей лаборатории, Хосе Суарес. Данную процедуру можно проводить в аэробных условиях. Сначала взвесьте образец кала.

Это необходимо для подсчета количества c difficile в кале. Затем ресуспендируйте образец кала в 1 XPBS и перемешайте на вортексе, чтобы обеспечить полную ресуспендирование образца. Далее проведите серию разведений ресуспендированного образца кала в 1 XPBS для последующей изоляции или подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ) на грамм кала.

Выполняйте процедуру в анаэробных условиях, чтобы вегетативные клетки C difficile не подвергались воздействию кислорода. Анаэробная камера, используемая в данном эксперименте, поддерживается при температуре 37 °C. Соблюдайте правила асептики.

Нанесите по 100 µL каждого серийного разведения на чашки с агаром Toro collate oxetane, cyclo Seine, фруктозой или T-C-C-F-A. Эти чашки предварительно выдерживали в анаэробной камере не менее одного-двух часов для полного удаления остаточного кислорода. Это необходимо для изоляции колоний с целью точного подсчета или для дальнейшего использования в других приложениях.

С помощью стерильной инокуляционной петли равномерно распределите нанесенную культуру по поверхности чашки с T-C-C-F-A агаром. Инкубируйте чашки в анаэробных условиях при 37 °C в течение 48 часов. Идентифицируйте колонии c difficile по их плоскому, неправильному виду, напоминающему матовое стекло, чтобы убедиться, что вегетативные формы c difficile не погибли при воздействии кислорода.

Чашки для изоляции колоний для последующего использования должны постоянно находиться внутри анаэробной камеры. Для подсчета колоний чашки можно выносить за пределы анаэробной камеры. Обратите внимание, что после выноса чашки из камеры вегетативные формы c difficile подвергнутся воздействию кислорода и погибнут.

Эти колонии C difficile не удастся восстановить, даже если вернуть чашку в камеру. Подсчитайте количество колоний C difficile для каждого разведения и рассчитайте число КОЕ на грамм образца кала для культивирования и создания глицериновых стоков C difficile. Используя стерильную инокуляционную петлю, выделите отдельную колонию и проведите посев штрихом на предварительно восстановленный мозгово-сердечный бульон.

На чашки с агаром BHIS, дополненный дрожжевым экстрактом или 0,03% L-цистеином, высейте отдельные колонии и проведите посев по квадрантам, используя новую стерильную инокуляционную петлю для каждого квадранта. Инкубируйте чашки в анаэробных условиях при 37 °C в течение 16–24 часов. После появления изолированных колоний на чашках с агаром BHIS выберите одну изолированную колонию и ресуспендируйте ее в 10 мл предварительно восстановленной жидкой среды BHIS, дополненной 0,03% L-цистеином, и инкубируйте в течение ночи.

Инкубируют в анаэробных условиях при 37 °C или до помутнения культуры. На следующий день в криопробирку объемом 1,8 мл добавляют 333 µL 50% глицерина и 666 µL культуры C. difficile. Для создания 15% глицеринового стока изолированного штамма криопробирку плотно закрывают крышкой и перемешивают.

Сразу извлеките сток из анаэробной камеры и поместите его в морозильную камеру при -80 °C для длительного хранения. Чтобы начать данную процедуру, извлеките замороженный глицериновый сток c difficile из морозильной камеры при -80 °C. Чтобы предотвратить размораживание.

Немедленно поместите замороженный глицериновый сток в охлаждающую стойку, которая перед использованием хранилась при температуре -80 °C. Перенесите замороженный глицериновый сток в охлаждающей стойке в анаэробную камеру, используя асептическую технику и стерильную инокуляционную петлю. Нанесите небольшое количество культуры на чашку и проведите посев штрихом по одному квадранту чашки.

Поверните планшет на 90 градусов и, используя новую стерильную инокуляционную петлю, проведите посев по второму квадранту. Повторите процедуру для третьего и четвертого квадрантов, чтобы обеспечить изоляцию отдельных колоний. Немедленно извлеките замороженный глицериновый сток из анаэробной камеры и верните его в морозильную камеру при температуре -80 °C.

Инкубируйте планшет в анаэробных условиях в течение ночи при 37 °C для очистки спор из культуры c difficile. Перенесите штаммы из замороженного глицеринового стока на предварительно восстановленные чашки с BHIS, следуя процедуре, продемонстрированной в предыдущем сегменте.

Инкубируйте в анаэробных условиях в течение ночи при 37 °C. На следующий день пересейте отдельные колонии на несколько предварительно восстановленных чашек с агаром 70:30. Инкубируйте в анаэробных условиях при 37 °C от 24 до 48 часов.

После образования спор извлеките чашки из анаэробной камеры. Снимите содержимое чашек стерильной инокуляционной петлей и ресуспендируйте клетки в 10 миллилитрах стерильного 1X PBS. Утилизируйте чашки, осадите клетки центрифугированием при 3000 G в течение 15 минут.

Удалите супернатант, добавьте один миллилитр суспензии 1×PBS, ресуспендируйте и снова осадите таким же образом. Промойте клетки дважды в PBS, инкубируйте при 4 °C в течение ночи, чтобы облегчить лизис вегетативных и материнских клеток на следующий день, затем инкубируйте при 70 °C в течение 20 минут для уничтожения любых оставшихся вегетативных клеток. Для определения КОЕ на миллилитр проведите серийное разведение каждой подготовки спор в 1×PBS и высейте на предварительно восстановленный BHIS с добавлением 0,1% Sodium Toro collate; инкубируйте чашки при 37 °C минимум 24 часа перед подсчетом колоний.

Споры можно хранить в 1XPBS при комнатной температуре для краткосрочного хранения или при температуре 4 °C для длительного хранения. А. Здесь представлен пример роста C. difficile на среде BHIS и на анаэробном кровяном агаре Columbia с кровью овцы.

C difficile образует неправильные плоские колонии с видом «матового стекла», что отчетливо заметно на обеих средах. На панели A представлен клинический изолят C difficile 630 E, чувствительный к эритромицину, выращенный в течение 24 часов на агаре BHIS — обогащенной неселективной среде. При 37 °C колонии на анаэробном кровяном агаре Колумбия (кровь овцы), показанные на панели B, при белом свете выглядят аналогично колониям, выращенным на BHIS.

Однако использование этой среды также позволяет обнаружить зеленоватую или цитрусовую флуоресценцию, которой обладает C difficile при воздействии длинноволнового ультрафиолетового излучения, что показано на панели C после выполнения данной процедуры. Для решения дополнительных вопросов молекулярной биологии могут быть применены другие методы, такие как построение кривых роста в жидкой среде, выделение ДНК и РНК, изоляция колоний, ПЦР и другие методы молекулярно-биологического анализа и манипуляций, подходящие для C difficile, а также использование спор C difficile в исследованиях на животных. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изолировать, культивировать и поддерживать вегетативные клетки и споры C difficile в анаэробной среде.

Не забывайте, что C. difficile является патогеном человека и животных, который может вызывать желудочно-кишечные заболевания. Эксперименты с C. difficile должны проводиться в условиях соответствующего второго уровня биологической безопасности.