Изучение взаимодействий Золотистый стафилококк С нейтрофилами с помощью проточной цитометрии и микроскопии Длительная

Общей целью данного эксперимента является изучение влияния стафилококкового фенола, растворимого модлина или ПСМ на нейтрофилы человека. Это достигается путем предварительного выделения нейтрофилов из крови человека для последующего анализа in vitro. Затем нейтрофилы либо загружаются флуоресцентным красителем и смешиваются с серией ПСМ в концентрации с ингибиторами и без них, либо им разрешается фагоцитировать бактерии S reus, содержащие альфа-промотор ПСМ репортерной конструкции GFP.

В конечном счете, активация нейтрофилов при стимуляции ПСМ может контролироваться с помощью проточной цитометрии и экспрессии GFP фагоцитозом. Бактерии могут быть проанализированы с помощью флуоресцентной микроскопии С помощью этого метода. Вы можете изучить эффекты стафилококковых, фениловых, соевых, молинов или нейтрофилов.

Конечно, этот метод может быть применен ко многим другим типам клеток, раздражителей и антагонистов. Впервые у нас возникла идея микроскопической части этого метода, когда мы обсуждали способ наблюдения за эффектами ПСМ внутри нейтрофилов. Использование конструкции экспрессии GFP бактерий и покадровой микроскопии позволяет нам сделать именно это.

После забора пяти пробирок гепаринизированной венозной крови налейте 12 миллилитров фиального раствора плотностью 1,119 грамма на миллилитр в 50 миллилитров пробирки, а затем осторожно налейте 10 миллилитров раствора FI плотности 1,077 грамма на миллилитр. Затем разбавьте кровь равным объемом PBS и аккуратно нанесите от 20 до 25 миллилитров крови на каждый двойной слой fi call gradient. Центрифугируйте градиенты в течение 20 минут при температуре 396 G и 22 градусах Цельсия без разрыва.

А затем с помощью вакуумного насоса, оснащенного стерильным наконечником для дозатора, можно отсасывать верхние слои желтой плазмы и PBMC. А затем третий белый слой. Теперь с помощью небольшой пластиковой пипетки перенесите полиморфноядерную фракцию нейтрофилов или PMN из каждой пробирки в новую 50-миллилитровую пробирку.

Добавьте в каждую пробирку свежеприготовленный предварительно охлажденный наш PMI с добавлением сывороточного альбумина человека или R-P-M-I-H-S-A, чтобы довести общий объем до 50 миллилитров. Затем раскрутите клетки, аспирируйте надосадочную жидкость с помощью вакуумного насоса и аккуратно переведите курсор на красные эритроциты и гранулы, содержащие PMN. Далее добавьте в клетки девять миллилитров стерильной деионизированной воды и запустите таймер.

Прибавьте ровно 30 секунд. Добавьте один миллилитр в 10 раз концентрированную PBS, чтобы остановить гиперосмотический шок. Затем промойте клетки в общем объеме 50 миллилитров холодным R-P-M-I-H-S-A.

После удаления надосадочной жидкости добавьте по одному миллилитру R-P-M-I-H-S-A в каждое небо, которое теперь белое из-за лизиса эритроцитов. Затем пересушить, подвесить пипетированием и соединить гранулы в одну пробирку. Теперь посчитайте ячейки и отрегулируйте концентрацию от одного умноженного на 10 до седьмой клетки на миллилитр.

Теперь загрузите пять раз по 10 до шестой клетки на миллилитр с двумя микромолярами гриппа в 3:00 утра в R-P-M-I-H-S-A. И накройте трубку алюминиевой фольгой, чтобы защитить ее от света. Далее инкубируйте клетки в течение 20 минут при температуре под перемешиванием.

Тем временем приготовьте трехкратное серийное разведение стимула в 10 раз выше конечной концентрации. Затем предварительно инкубируйте 30 микролитров раздражителя с равным объемом свежеприготовленного в 10 раз концентрированного ингибитора или буфера в течение 10 минут при комнатной температуре. Далее промойте клетки в 10 миллилитрах R-P-M-I-H-S-A и ресуспендируйте клетки в свежем R-P-M-I-H-S-A в соотношении пять раз по 10 до шестой клетки на миллилитр.

Непосредственно перед анализом потока разбавьте клетки до двух умно-10-шестых клеток на миллилитр в R-P-M-I-H-S-A и добавьте 200 микролитров клеток на факсимильную трубку. Соблюдая осторожность, чтобы не активировать клетки путем встряхивания или пипетирования, загрузите первую пробирку на проточный цитометр. Подождите три секунды, а затем начните сбор данных через фиксированный промежуток времени, например, восемь секунд, снимите пробирку и быстро добавьте в образец 50 микролитров минимального разбавления стимула.

Немедленно перезарядите трубку и продолжайте захват. Когда серия разведения будет завершена, промойте иглу проточного цитометра свежей R-P-M-I-H-S-A перед измерением новой серии. После запуска последнего образца проанализируйте данные с помощью программного обеспечения для анализа проточной цитометрии, чтобы проанализировать экспрессию GFP у бактерий.

После того как при фагоцитозе PMN в течение ночи в бульоне вырастит штамм Sous, содержащий представляющий интерес репортерный конструкт, удалите любую GFP, экспрессированную во время ночного культивирования, разбавив клетки до OD 6 60 0 0,01. Выращивание культуры до OD 6 60 0 0.1. Разбавляйте клетки от одного до 30, а затем контролируйте рост до тех пор, пока культура снова не достигнет OD 660 от 0,1.

Затем соберите бактерии с помощью центрифугирования. Промойте клетки один раз в DPBS и Resus. Приостановите культуру.

Прибавьте один к 10 от исходного объема, чтобы получить внешний диаметр шесть 60 от 1,0 или примерно пять умножить на 10 к восьмому КОЕ на миллилитр. Теперь смешайте бактерии со свежевыделенным ПНС в R-P-M-I-H-S-A в соотношении 10 к одному. Затем добавьте объединенную человеческую сыворотку к одному 10-му общему конечному объему объединенной человеческой сыворотки в клеточном растворе.

Стимулируйте фагоцитоз, встряхивая клеточную смесь в течение 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Затем разбавьте нагруженные бактериями PMN до 5 умно-10 на пятую клетку на миллилитр и перенесите по 250 микролитров клеток в каждую лунку с восемью камерами. Наконец, визуализируйте клетки на инвертированном микроскопе, оснащенном объективом с 40-кратным увеличением и помещенном в камеру темной среды, и получайте изображения в нескольких местах в камерах скольжения крышки каждые 5-10 минут как в светлом поле, так и в канале GFP, чтобы следить за продукцией бактерий GFP в режиме реального времени, инкубируя нейтрофилы с серией концентраций синтетического PSM альфа 3, что приводит к дозозависимой быстрой активации ячейки, измеренные с помощью потока кальция.

Предварительная инкубация альфа-3 пептида ПСМ с 0,01%0,1% или 1% сыворотки крови человека значительно ингибировала способность стимула вызывать кальциевый ответ. Опять же, в зависимости от дозы в 1% сыворотке. Практически не наблюдается никакой активации при этих альфа-трех концентрациях PSM.

На этих изображениях показаны два нейтрофила, содержащие фагоцитозные бактерии, содержащие репортерную конструкцию A PSM alpha GFP. Бактерии начинают флуоресцировать примерно через час после фагоцитоза, что указывает на экспрессию GFP от промотора PSM Alpha. Бактерии вне нейтрофилов не флуоресцируют, что указывает на то, что экспрессия альфа-ПСМ быстро включается только при фагоцитозе бактерий.

При попытке этой процедуры важно помнить о том, что для достижения оптимальных результатов всегда нужно использовать свежие нейтрофилы. Я надеюсь, что после просмотра этого видео у вас сложилось хорошее понимание того, как измерить поток кальция с помощью проточной цитометрии и как измерить экспрессию бактериальных генов внутри эукариотических клеток с помощью флуоресцентной микроскопии.