Одновременное электрофизиологические записи и Кальций изображений супрахиазматического ядра нейронов

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы изучить взаимодействие между изменениями напряжения или тока, такими как изменения в действии, потенциальной частоте возбуждения и внутриклеточной концентрации кальция в нейронах супраматического ядра. Это достигается за счет подготовки среза мозга к регистрации нейронов ядра СМА с помощью микроэлектрода, заполненного кальциевым чувствительным зондом. На втором этапе микроэлектрод герметизируется с мембраной нейрона.

Затем мембрана нейрона, запечатанная микроэлектродом, разрывается для введения флуоресцентного зонда кальция в отдельные нейроны и для записи вместе с мембраной результатов электрической активности, которые показывают измерения напряжения или тока и изображения флуоресценции кальциевого зонда на двух длинах волн, изменение отношения флуоресценции на этих длинах волн отражает изменение внутриклеточного кальция внутри нейрона. Последующий анализ может быть выполнен для определения концентрации кальция в клетке. Основное преимущество этой методики заключается в том, что изменения электрической активности мембраны и внутриклеточного кальция, продуцируемого синаптической активацией, могут быть одновременно измерены в отдельных нейронах супракосметического ядра.

Демонстрировать эту технику будет мой коллега доктор Роберт Ирвин. Начните эту процедуру с того, что поместите мозг крысы на круглую фильтровальную бумагу, смоченную в растворе для резки, на стеклянную чашку Петри, положив его на лед, разрежьте корону мозга только для удаления мозжечка и ствола мозга, и отрежьте участки правой и левой сторон коры, оставив блок мозга, содержащий гипоталамус, и тщательно сохранив вентральную сторону мозга, содержащую зрительные нервы SCN и зрительный хиазма. После этого нанесите тонкий слой акрилового клея Сано, достаточно большой, чтобы прикрепить мозг и блоки в ледяной камере для нарезки микротома.

Перенесите ледяной мозговой блок стороной вниз на клей так, чтобы сторона, содержащая SCN, располагалась для резки первой, а зрительные нервы, образующие букву V, указывали вверх, разместили блоки aros с трех других сторон. Затем заполните камеру ледяным буфером для нарезки и непрерывно пузыритесь карбогеном. Акриловый клей Sano затвердевает от влаги и удерживает мозг и блоки на месте.

Затем разрежьте срезы коронального гипоталамуса, содержащие SCN, толщиной от 220 до 250 микрон. Обратите внимание, что левый блок арос отсоединился во время резки. Это может произойти при недостаточном нанесении клея.

После этого определите срез, содержащий SCN. Как правило, срез выбирается там, где зрительная хиазма составляет от двух до четырех миллиметров в поперечнике и выглядит как белая полоса, а СХЯ дорсально проявляется в виде двух небольших углублений в зрительном хиазме по обе стороны от третьего желудочка. Перенесите срез в записывающую камеру с температурой 36 градусов Цельсия, установленную на предметном столике микроскопа.

Камера заполнена непрерывно текущим записывающим раствором со скоростью два миллилитра в минуту. Аэрируется 95% карбогеном и предварительно нагревается с помощью встроенного нагревателя. Определите SCN, наблюдая за двумя полупрозрачными ядрами SCN по обе стороны от третьего желудочка, дорсально по отношению к зрительному хиазму, который выглядит как черная полоса при освещении проходящим светом.

Чтобы подготовить микроэлектрод к записи, заполните его внутренним раствором, содержащим кальциевый зонд, отфильтрованный четырехмиллиметровым шприцевым фильтром через микронаполнительную трубку. Затем поместите микроэлектрод в держатель микроэлектрода. Далее приложите к электроду небольшое количество постоянного положительного давления.

Опустите микроэлектрод в записывающую камеру под руководством красной подсветки. Затем поместите микроэлектрод на SCN с помощью объектива с низким энергопотреблением. После этого переключите микроскоп в режим увеличения большой мощности для выделения подобласти СХЯ и отдельного нейрона СХЯ.

Продолжайте оказывать мягкое положительное давление на микроэлектрод по мере его продвижения к поверхности клетки. Как только он окажется на поверхности, приложите мягкое отрицательное давление, чтобы сформировать уплотнение с сопротивлением от трех до 10 гигаом. После этого отрегулируйте напряжение мембраны до минус 60 милливольт.

Затем приложите дополнительное отрицательное давление к электроду, чтобы разорвать клеточную мембрану с целью формирования зажима всего клеточного участка. При входе в режим всей клетки сома и дендриты SCN будут заполнены флуоресцентным зондом. Измерьте напряжение мембраны в режиме точного зажима или ток в режиме зажима напряжения.

В то время как данные изображения кальциевого зонда отслеживаются и сохраняются, полученные изображения можно просматривать вместе с графиком данных флуоресценции с отношением 340 нм и 380 нм. Во время эксперимента монохронометр используется для получения количественных измерений кальция путем быстрого воздействия на SCN ультрафиолетового света. На 340 нанометрах и 380 нанометрах возбуждающий свет проходит через оптический фильтр UG 11 для ограничения гармонических длин волн выше 400 нанометров, а 400-нанометровое дихроичное зеркало DCLP отражает свет на ткань.

Излучаемый свет проходит через эмиссионный фильтр с яркостью 510 нанометров и фиксируется камерой. Чтобы проанализировать результат, выберите интересующую область исходного изображения и область фона, которую необходимо преобразовать в единицы относительной интенсивности флуоресценции. Данные об интересующей области видны в режиме реального времени во время эксперимента.

Предыстория используется позже при последующем анализе данных. Вот яркое изображение коронального среза гипоталамуса, содержащего СХЯ и хиазму зрительного нерва. Стеклянный микроэлектрод, заполненный внутренним раствором, содержащим BISRA 2, запаивается на один нейрон.

Здесь показаны реакции кальция на серию из 50 шагов напряжения, записанных от зажатого напряжением нейрона SCN. Потенциально-зависимые натриевые токи ингибировали с помощью 0,5 микромолярного TTX, и это изображение на экране соматических и дендритных областей, представляющих интерес, соответствующих кальциевым реакциям. Это примеры реакции кальция на переменное число ступеней напряжения.

На этом рисунке показана одновременная регистрация напряжения мембраны и внутриклеточного кальция. В нейроне СХЯ текущий эксперимент с зажимом проводили в присутствии 50 микромолярного ритоксина. Небольшая деполяризация мембранного потенциала вызывала несколько приступов действия, возбуждение потенциала с соответствующим повышением и последующим падением внутриклеточного кальция.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как готовить здоровые надкосметические срезы ядра мозга, а также проводить одновременные электрофизиологические и визуализирующие эксперименты. Не забывайте, что работа с ультрафиолетовым излучением может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение надлежащих защитных очков.