Одно-муха Анализ на нагула поведения в Дрозофилы

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы количественно оценить поведенческие изменения, вызванные лишением пищи у взрослой мухи Salala Melanogaster. Это достигается путем первого голодания мух в течение 18-24 часов. Второй шаг заключается в загрузке отдельных мух в поведенческие камеры, каждая из которых содержит привлекательный источник запаха в своем центре.

Затем компьютерная система с цифровой камерой отслеживает положение каждого пролета во времени и записывает. Его координаты для последующего анализа данных. Последним шагом является определение задержки каждой мухи до источника запаха с помощью специального программного обеспечения.

В конечном счете, этот высокопроизводительный анализ поведения при поиске пищи может быть использован для изучения взаимосвязи между функцией нейронной сети и поведенческими реакциями. Основное преимущество этого анализа по сравнению с существующим методом, как и у его товарищей по команде, заключается в том, что он количественно оценивает хемотаксическое поведение у одиночных мух. Этот метод может помочь ответить на вопросы нейробиологии, например, какие нейроцепи важны для хемотаксического поведения и как эти нейроцепи регулируются внутренним физиологическим состоянием животного.

Целью этого метода является получение больших наборов данных о поведении за короткое время. Хотя этот метод дал нам представление о поведении при добывании пищи, он также может быть использован для изучения других видов поведения, таких как локализация корма. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение.

Правильное обращение с мухами и выполнение компьютерного программного обеспечения имеют важное значение для успеха этого эксперимента. Как правило, новички в этом методе могут испытывать некоторые трудности в начале, потому что требуется некоторое время и терпение, чтобы научиться обращаться с мухами осторожно, демонстрируя процедуру с помощью иглы. Свяжитесь с техником для моей лаборатории Сбор перед полетом.

Задняя часть экспериментальных мух в условиях контролируемой температуры и влажности в течение 12-часового цикла световой темноты. В день взрыва ЕЭС обезболите мух под действием углекислого газа, прежде чем определять их пол под микроскопом. Для дифференциации между самцами и самками можно использовать несколько основных критериев.

У самцов есть участок черной щетины на четырех ногах, называемый половыми гребнями, которых у самок нет. Кроме того, кончик брюшка самца покрыт темной кутикулой и обнажены гениталии, не встречающиеся у самок, собирают самок мух и помещают их вместе с четырьмя-пятью белоглазыми самцами в новые пищевые файлы максимум с 30 мухами на один возраст флакона. Мухи в течение двух-пяти дней подготавливают камеры к голоданию мух, сначала проталкивая одну салфетку на дно пустого пластикового флакона, полностью пропитывая ткань дистиллированной водой.

Затем с помощью предмета надавите на ткань и аккуратно отожмите лишнюю воду. Переверните флакон, чтобы сбросить лишнюю воду. Воды должно быть достаточно, чтобы мухи оставались гидратированными, а камера голодания влажной, но недостаточно, чтобы утопить мух.

Примерно за 18-24 часа до начала эксперимента перенесите мух из флакона с едой в камеру для голодания и закупорьте флакон. Храните флаконы при контролируемой температуре и влажности в течение ночи до начала эксперимента. Приготовьте 1%-ный раствор агро, добавив 100 миллиграммов низкой температуры плавления на 10 миллилитров дистиллированной воды.

В стеклянной колбе. Нагрейте агрораствор в микроволновой печи до тех пор, пока он не закипит, но пока он не закипит, остановите микроволновку и прокрутите колбу один раз. Повторите этот шаг еще дважды, пока арос полностью не растворится.

Поддерживайте раствор Aros в жидком состоянии, держа колбу в тепле на горячей плите. Установите температуру 50 градусов по Цельсию, добавьте 990 микролитров 1%-ного раствора и 10 микролитров яблочного уксуса в 1,5-миллилитровую трубку DF. Чтобы приготовить 1%-ный раствор яблочного уксуса, перемешайте раствор до смешивания перед помещением в сухую ванну инкубатора, установленного на 50 градусов Цельсия, установите в испытательном помещении нужные условия, такие как температура и влажность.

Включите светодиодную панель с яркостью 660 нанометров. Промойте сита и тестовые пластины горячей водой и нагрейте их в сушильном шкафу до тех пор, пока вся влага не испарится. Классно. Сита и пластины снижаются до испытательной комнатной температуры.

Перед началом экспериментов поместите неглубокую тарелку на верхнюю часть диффузорной пластины и наполните ее водой, чтобы повысить местную влажность и замаскировать воду в капле арос. Наконец, расположите сита над миской с водой. Тестовая пластина изготовлена из прозрачного акрила и состоит из шести испытательных арен.

Ползунок содержит камеры хранения, которые позволяют загружать мух, временно удерживать и одновременно выпускать шесть мух в соответствующие камеры. В начале эксперимента перекрестие, выгравированное в центре каждой арены на пластине, указывает на то, что одоранты должны быть дозированы. Вставьте ползунки в акриловую тестовую пластину.

Осторожно вставьте аспиратор во флакон мимо ватной пробки и позвольте примерно шести мухам пройти в аспиратор. Очень важно быть как можно более бережным в обращении с ними. Можно воспользоваться фототактикой, поведением мухи, чтобы вызвать мух, подойти к аспиратору, направив отверстие флакона на тусклый источник света.

При необходимости можно применить мягкое отсасывание для аспирации примерно шести самок мухи. Избегайте выбора белоглазых самцов мух. Вставьте наконечник аспиратора в первое отверстие тестовой пластины.

Дайте одной мушке пройти в ячейку удержания и осторожно переместите ползунок вперед, чтобы загрузить еще одну мушку в следующее отверстие. Продолжайте до тех пор, пока не полетит. Занимаем все шесть удерживающих ячеек пластины.

Затем нанесите пипеткой пять микролитров 1%-ного раствора агарро яблочного уксуса непосредственно в центр перекрестия на внутренней поверхности тестовой пластины. Чтобы выровнять тестовую пластину по центру, откройте файл с именем Инструмент позиционирования vi. Запустите файл, нажав на белую стрелку в левом верхнем углу экрана.

Поместите тестовую пластину на верхнюю часть сиба таким образом, чтобы отверстие арены было обращено к полу SIV, а мишень запаха находилась на потолке пластины. После завершения юстировки совместите перекрестие испытательной пластины с перекрестными воздухами на экране монитора. Прервать выполнение можно нажатием на красную точку, расположенную в левом верхнем углу монитора, чтобы отследить и записать координаты мухи.

Во время каждой попытки поиска продуктов питания открывайте файл программного обеспечения для сбора данных. Отслеживание мухи шесть vi. Запустите файл, нажав на белую стрелку в левом верхнем углу монитора.

Назначьте файлу имя и нажмите кнопку ОК. Перемещайте ползунки в испытательных камерах, чтобы выпустить мух в испытательные арены. Будьте осторожны и не перемещайте испытательные камеры, так как это приведет к неправильной записи координат.

Нажмите «Пуск» и убедитесь, что единственным источником света в испытательной камере является светодиодная панель. Когда испытание будет завершено, снимите сито и поведенческую камеру. Поднимите тестовую пластину из сита и удалите мух, погрузив пластину в лед.

Аккуратно очистите тарелку горячей водой и удалите остатки агроса. Поместите тестовые пластины в сушильную печь, чтобы удалить влагу. Проветрите зону тестирования, включив небольшой вентилятор примерно на две минуты.

Выключите вентилятор и загрузите следующую группу мух в следующую тестовую пластину. Перейдите к выполнению анализа данных с помощью пользовательского программного обеспечения, как описано в текстовом протоколе. Программное обеспечение для анализа данных и макет используются для оценки производительности каждой мухи во время ее 10-минутного испытания в соответствии с набором критериев анализа.

Эти критерии используются для определения того, будут ли данные от каждой мухи использоваться для анализа данных, и предназначены для устранения тех мух, которые не могут выполнить задачу по поиску пищи из-за травмы, болезни, стресса или отсутствия мотивации, мухи, которые бездействуют более 300 секунд, считаются неактивными и исключаются из набора данных, если им уже не удалось найти источник пищи или экспонат. Средняя скорость более 10 миллиметров в секунду в течение как минимум 100 секунд после периода неактивности позволяет выбрать только тех мух, которые демонстрируют здоровую скорость на ранних стадиях активного запаха. Для анализа данных принимаются только поисковые мухи, которые движутся в определенном диапазоне скоростей в течение первых 50 секунд испытания; мухи, которые не проходят через все четыре квадранта на арене и направляются прямо к источнику пищи после начала испытания, отклоняются.

Мухи, которые петляют к источнику пищи и удаляются от него в радиусе 10 миллиметров в течение как минимум 50 секунд, считаются успешно нашедшими источник пищи. График, изображающий расстояние от мухи до источника запаха во времени, может быть использован для оценки этого редкого случая арены с видимыми артефактами в положении мухи. Трассировки также отклоняются.

Артефакты могут создаваться в результате любого события, в котором программное обеспечение для сбора данных обнаруживает объект, отличный от мухи. Они часто выглядят как длинные прямые линии, которые проходят через арену или расходятся расходами от ее центра. Взрослые мухи, которых голодают от 18 до 24 часов, демонстрируют более высокую обонятельную чувствительность к запахам, связанным с пищей, чем их собратья, которых кормили.

Графический график совокупного процента мух, которые успешно обнаруживают источник запаха пищи, показывает, что 30% всех голодающих мух добиваются успеха в течение 10-минутного окна. Для сравнения, только 7% всех накормленных мух делают это. Голодные мухи должны проявлять значительно большее влечение к уксусу, чем к одному транспортному средству agros, и это наблюдение может быть использовано для устранения неполадок в условиях тестирования.

Например, когда этот эксперимент по поиску пищи, который проводился при температуре 32 градуса Цельсия при влажности окружающей среды 35% с использованием диких типов мух, не было обнаружено существенной разницы между влечением мух к уксусу и контролем ароса, что, вероятно, связано с возрастающим притяжением к воде, обнаруженной в капле агроса при более высоких температурах тестирования. При повышении влажности теста до 50-60% этот поведенческий сдвиг был скорректирован, и значительная разница между влечением к уксусу и агротранспортным средством была восстановлена. После освоения эта техника может быть выполнена за 12 минут, включая 10-минутную экспериментальную пробу, если она выполнена правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что обращаться с мухами нужно очень осторожно, чтобы не поранить или не потревожить их. Пожалуйста, помните, что тестовые пластины и сита могут быть очень горячими в сушильном шкафу, поэтому их следует снимать во время ношения рукавиц после их проявки. Этот метод проложил путь исследователям в области нейробиологии к изучению хемотаксического поведения.

Этот метод также может быть адаптирован для изучения способности мухи находить другие объекты запаха. Например, он может быть применен для изучения поведения локализации партнера у самцов мух. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как подготовиться к эксперименту, скорректировать условия эксперимента, провести эксперимент и проанализировать производительность каждой мухи, что в конечном итоге предоставит вам кумулятивный график, показывающий процент мух, которые успешно обнаружили источник запаха.