Конфокальной микроскопии одиноких митохондриальных супероксид вспышек в интактных Сердце или В Vivo

Общая цель этой процедуры заключается в мониторинге отдельных митохондриальных событий, таких как вспышки супероксида и флуктуации мембранного потенциала in situ или in vivo, для достижения оценки функции митохондрий в режиме реального времени в физиологически значимом контексте. Это достигается путем предварительного обнажения скелетных мышц в задней конечности мыши. Затем покадровые конфокальные изображения скелетных мышц получаются in vivo.

Затем сердце мыши перфузируется и визуализируется с помощью конфокальной микроскопии. Наконец, изображения обрабатываются и анализируются данные. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают одиночные митохондриальные вспышки супероксида и колебания мембранного потенциала в скелетных мышцах, in vivo или в перфузированном сердце с помощью покадровой съемки и двумерных конфокальных изображений.

Основное преимущество этой методики перед существующими мышцами, такими как оценка функции митохондрий в изоляции митохондрий, заключается в том, что эта техника позволяет в режиме реального времени оценить функцию отдельных митохондрий в физиологически значимых условиях. Мы демонстрируем этот метод критически важно, так как конфокальную визуализацию ножа, животного или ткани ножа трудно освоить, потому что это более крутая и сложная процедура. После приготовления изотонического сбалансированного солевого раствора или IBSS, Krebs HENSEL Light Buffer или KHB и хирургических инструментов согласно текстовому протоколу обезболивайте мышь внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала и выполните щипнение пальца ноги для подтверждения того, что животное находится под действием седативных препаратов.

С помощью бритвы удалите шерсть на одной из задних конечностей перед дезинфекцией участка 70% этанолом. Далее сделайте разрез на коже вдоль внешней стороны конечности, чтобы обнажить мышцы желудочной анемии. Затем с помощью острых щипцов аккуратно подхватите эпимизий и с помощью ножниц сделайте через него надрез.

Далее рассекайте, чтобы удалить эпимизий и обнажить мышечные волокна под ним. Добавьте в IBSS 500 наномолярного тетраэтила, метиловый эфир домина палочки или TMRM и погрузите мышцу в раствор на 30 минут. После загрузки TMRM в мышцу промойте мышцу с помощью IBSS без TMRM с помощью 40-кратного масляного объектива.

Положите мышь на бок на предметный столик конфокального микроскопа и задержите заднюю конечность так, чтобы обнаженная скелетная мышца оказалась в специально изготовленной камере против защитного стекла. Затем осторожно надавите на ногу, чтобы обеспечить плотный контакт между тканью и покровным скольжением, и погрузите открытые мышцы в IBSS, используя восьмибитную глубину пикселей и частоту дискретизации в одну секунду на кадр, запишите двухмерное серийное сканирование мышцы. Собирайте последовательные изображения, сначала захватывая на 405 нанометрах и собирая их на глубине более 505 нанометров.

Затем захватывающий на 488 нанометрах и собирающий на более чем 505 нанометрах. Для двухволнового возбуждения МТ. CCP YFP, использует последовательное возбуждение на 405, 488 и 543 нанометрах и собирает излучение на 505-5, 45,505-5, 45-55 и более 560 нанометров соответственно. Для визуализации M-T-C-P-Y-F-P с тройной длиной волны и TMRM для визуализации сердца мыши введите животному 200 единиц гепарина.

Подождав 10 минут и усыпив мышь методом торакотомии, быстро удалите сердце и легкие, а также прикрепленный к ней тимус. Быстро переведите имплантированную ткань в ледяной ИБСС. Затем определите доли тимуса и аккуратно отшлифуйте их обратно.

Чтобы обнажить восходящую аорту, удалите легкое и тимус и изолируйте аорту, осторожно удалив все окружающие ткани. Далее сделайте разрез на верхнем конце восходящей аорты перед первой ветвью дуги аорты. Затем с помощью двух микрощипцов для наложения швов аккуратно удерживайте стенку аорты, чтобы обнажить просвет, и осторожно поместите ее на канюлю.

Используйте зажим для микрососудов, чтобы удерживать аорту на месте и быстро завязать вокруг нее швы. Снимите зажим и с помощью щипцов тщательно проверьте, чтобы кончик канюли находился над корнем аорты. При необходимости закрепите дополнительные завязки, чтобы удержать сердце на месте.

Включите перистальтический насос и проведите перфузию сердца. При дозе одного миллилитра в минуту сердце возобновит биться после перфузии. После 10 минут стабилизации перфузируйте сердце 10 микромолярными статинами BLEs и 100-500 наномолярными TMRM.

Сердцебиение замедлится через 10 минут. Далее отрегулируйте положение перфузионной системы и поставьте сердце на предметный столик микроскопа, оснащенный адаптером для нагрева камеры до 37 градусов Цельсия. Добавьте в камеру один миллилитр перфузионного раствора KHB, чтобы частично погрузить сердце.

Используйте перистальтический насос для удаления сточных вод из камеры. Постепенно увеличивая скорость насоса, чтобы обеспечить достаточный приток к сердцу, обеспечить плотный контакт сердца с крышкой и еще больше подавить сердцебиение, оказывать мягкое давление на сердце. Изобразите орган так, как это было описано ранее в этом видео, регулируя фокальную плоскость, чтобы получить максимально четкое изображение.

Использование модуля физиологического анализа программного обеспечения конфокального микроскопа. Начните с открытия автоматически сгенерированной базы данных, а затем файла 2D-изображения для анализа. Нажмите на область интереса или среднее значение ROI.

Перейти в режим среднего значения ROIs. Выключите отображение каналов кроме CP YFP на 488 нанометрах для выбора вспышек. Увеличьте изображение и вручную переместите ползунок, чтобы воспроизвести серийные 2D-изображения.

Затем определите одиночные митохондриальные вспышки супероксида, определив участок, где флуоресцентный сигнал временно увеличивается. Используйте соответствующий инструмент ROI, чтобы отметить вспышки, след, показывающий зависящее от времени изменение флуоресценции каждого ROI, будет отображаться рядом с изображением. Выбрав все вспышки, включите отображение других каналов.

Выберите ROI на изображении за пределами ячейки для вычитания фонового сигнала. Затем выведите среднюю флуоресценцию каждого ROI вместе с временными метками. Запишите количество вспышек в каждом из файлов изображения последовательного сканирования, а также время сканирования и площадь ячейки.

Используйте Excel для вычисления частоты вспышек как количества вспышек за 100 секунд и на площадь ячейки 1000 квадратных микрон. Рассчитать время амплитуды до пика и время затухания для каждой вспышки. Используйте специально разработанную программу для анализа параметров флэш-памяти, которая является частью специально разработанной программы, написанной на интерактивном языке данных.

С помощью этого протокола in vivo можно проводить визуализацию отдельных митохондриальных событий в скелетных мышцах мышей, находящихся под наркозом, с последующей визуализацией в перфузированном сердце. Как показано здесь. TMRM, который является индикатором потенциала митохондриальной мембраны, часто используется для проверки местоположения M-T-C-P-Y-F-P и должен демонстрировать полное перекрытие с сигналом M-T-C-P-Y-F-P.

Его спектры отличаются от спектров CP YFP, и при использовании метода последовательного возбуждения сигналы излучения TMRM и M-T-C-P-Y-F-P не будут интерферировать друг с другом. Эти изображения демонстрируют, что одиночная митохондриальная супероксидная вспышка, сопровождающаяся деполяризацией мембраны, может быть идентифицирована на серийных изображениях 2D-сканирования, которые показали переходное увеличение флуоресценции по фоновым сигналам как в скелетных мышечных тканях, так и в миокарде. Помимо высокого разрешения, требуется также адекватная интенсивность флуоресценции.

Это может быть достигнуто за счет модуляции интенсивности лазера и усиления в собирающих каналах. В общем случае, базальный флуоресцентный сигнал от клетки устанавливается на уровне от одной трети до одной четверти максимальной интенсивности канала. Поскольку уровень экспрессии M-T-C-P-Y-F-P и нагрузка TMRM могут варьироваться у разных животных, для каждого эксперимента следует проводить тонкую настройку условий визуализации, как физиологических, так и патологических возмущений, таких как метаболические субстраты.

Электростимуляция, как показано здесь, и ишемическая реперфузия были использованы, чтобы показать, что активность супероксидной вспышки реагирует на изменения в клеточном метаболическом статусе. Пытаясь провести эту процедуру, важно помнить о поддержании соответствующей анестезии полости рта и правильном состоянии перфузируемого сердца. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как ишемия и спондилодез, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как митохондриальная дисфункция при лейкозе миокарда и реперфузионное повреждение.