Метод подготовки слайдов для сохранения трехмерной хроматиновой архитектуры клеток яичек яичек

Этот метод получения трехмерного предметного стекла сохраняет трехмерное расположение хроматина в клетках, как это было продемонстрировано на примере зародышевых клеток яичек мышей. Во-первых, проникните в свирепые канальцы, чтобы удалить цитоплазматические материалы и улучшить доступность окрашивающих реагентов, таких как антитела и рыбьи зонды. После фиксации ядерных материалов механически диссоциируйте половые клетки с помощью щипцов и выложите образцы цитозина на предметные стекла.

Затем получите данные с несколькими Z-сечениями, чтобы покрыть ядро в 3D, если оно применяется стратегически в результате подготовки к 3D-предметному стеклу. Используя COT одну РНК, рыба может показать зарождающиеся ядра РНК для обнаружения транскрипционно активных областей в ядре. Я разработал этот метод, когда работал в генетической лаборатории в Массачусетской больнице общего профиля.

В то время я оптимизировал метод подготовки предметного стекла для флуоресцентного анализа РНК хлопка до гибридизации, которую также называют рыбой для обнаружения нату. РНК. Хлопковые зонды могут гибридизировать повторяющиеся последовательности в интронах и tls и визуализировать сайт активной транскрипции. Хлопковые рыбы РА требуют сохранения распределения ядерной РНК.

Ключевым моментом этого правильного метода подготовки является то, что этапы фиксации должны продолжаться на этапе фиксации. Чтобы удалить плазменный фон Cy, распутайте канальцы OUS из разорванного яичка в PBS на льду, перенесите несколько кусочков канальцев длиной от пяти до 10 миллиметров в 500 микролитров буфера CSK с 0,5% триттона X 100 и инкубируйте в течение шести минут на льду. Теперь переведите все трубочки в 4%-ный раствор P-F-A-P-B-S в одну лунку из четырех лунок, чашку выдержите 10 минут при комнатной температуре.

Далее инкубируйте все трубочки в PBS в течение пяти минут при комнатной температуре. Установите камеры cyto spin и cyto spin во время инкубационных периодов на обратной стороне предметного стекла, перенесите все канальцы в 30 микролитров PBS. Затем с помощью кончиков двух щипцов оторвите трубочки на кусочки.

Измельчите канальцы в горизонтальном направлении, обрезав трубочки между кончиками двух щипцов и потянув щипцы горизонтально. После добавления 30 микролитров PBS перемешайте суспензию методом пипетирования, затем переложите ее в микроцентрифужную пробирку и добавьте PBS в общем объеме 1,3 миллилитров. Теперь нанесите по 100 микролитров суспензии на каждую из спиновых камер цито. Цито.

Вращайте образцы при 2000 об/мин в течение 10 минут при комнатной температуре. Высушите предметные стекла на лабораторном столе в течение нескольких минут при комнатной температуре, используя банку коплана, содержащую PBS. Вымойте горки в течение пяти минут при комнатной температуре.

Затем переложите предметные стекла на 70% этанол не менее чем на две минуты. В реакцию объемом 20 микролитров добавляют 100 нанограмм пойманного, 1D NA зонд, 20 миллимолярных рибонуклеотидных ванадиловых комплексов и гибридизационный буфер. С помощью ПЦР-аппарата инкубировать в течение 10 минут при температуре 80 градусов Цельсия, а затем ввести преа.

Встаньте на колени при температуре 42 градуса Цельсия до готовности к использованию. Теперь последовательно обезвоживайте предметные стекла в 80% этаноле в течение двух минут, а затем в 100% этаноле в течение двух минут. Полностью высушите предметные стекла на лабораторном столе при комнатной температуре.

Теперь поместите предметное стекло на наконечник коробки камеры при температуре 42 градуса Цельсия. Затем кратковременно центрифугируйте зонды и направьте их пипеткой непосредственно на обезвоженные предметные стекла. Аккуратно наденьте на предметное стекло защитную крышку для этапа гибридизации не менее шести часов при температуре 42 градуса Цельсия.

Разогрейте моющие растворы в баночках коплан при температуре 42 градуса Цельсия в течение 30 минут на водяной бане с помощью бритвенного лезвия, снимите крышку стекла с края предметного стекла, не царапая образцы, постепенно погружайте предметные стекла в моющий раствор на пять минут каждая. Начиная с первой банки coplan, содержащей два XSSC и 50%form амид, за которой следует вторая банка coplan, содержащая два XSSC и 50% form амида. А затем последние две баночки, содержащие два XSSC.

Затем добавьте к образцам 20 микролитров монтажного носителя DPI и установите крышку. Аккуратно нажмите на покровное стекло и промокните лишний монтажный носитель чистящей салфеткой. В этом эксперименте была проведена уловка одной РНК рыбы с одновременным обнаружением зарождающейся транскрипции и иммуноокрашивания белков, локализующихся в XY организме иммуногистохимией.

На этой послеоперационной палате сперматоциты обнаружили гетерохроматиновый белок CCB X one, а также фосфорилированную форму гистонового варианта H two A X на теле XY. Полученная рыба улавливала один сигнал, накопленный на ехроматических участках в поверхностных спредах, обработанных гипотоническим раствором. Трехмерная структура хроматина нарушается, и все оси миотических хромосом могут быть захвачены в пределах одной Z-плоскости.

Тем не менее, 3D-подготовка предметного стекла сохраняет неповрежденную структуру хроматина после этой процедуры. Этот правильный метод получения применим как для иммунофлюоресцентных ДНК и РНК рыб, так и для комбинации этих методов обнаружения.