Кусочек Культура Метод После Развитие Зуб микробов в эксплантата культуры
13 ноября 2013 г.
Здесь мы подробно метод культуры зубных микробов в нижней челюсти ломтиками использованием тканей вертолет. Этот метод позволяет уникальный доступ к зуба в процессе разработки, обеспечивая прекрасную возможность для манипуляций и рода трассировки, не доступен, используя более традиционные методы культивирования.
Общая цель следующего эксперимента состоит в том, чтобы проследить за развитием зубов в течение нескольких дней. В культуре in vitro explan это достигается путем рассечения развивающейся нижней челюсти эмбриональных мышей на живые срезы для обнажения развивающихся зачатков зубов в качестве второго шага. Срезы отбирают, помещают на фильтры над питательной средой и инкубируют для развития.
Затем срезы помечаются с помощью индикатора родословной для того, чтобы отслеживать движение клеток в течение периода культивирования, получаются результаты, которые показывают динамическую природу зубных тканей по мере их развития во время эксплан-культивирования. Основное преимущество этой методики перед традиционной культурой эксплантатов заключается в том, что внутренне развивающиеся органы, такие как драгоценные камни зубов, можно наблюдать на протяжении всего их развития в контексте окружающих тканей. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы измельчения и выбора могут быть затруднены, если настройка машины или ориентация ткани неточны.
Во-первых, приготовьте среду для диссекции и культивирования эмбриональных органов, добавив 1% глутамата и 1% пенициллина стрептомицина в 500 миллилитров модифицированной орлиной среды усовершенствованного ECCO F 12. Затем, как описано в видеостатье Такахаси Суми, препарируйте эмбрионы мышей между стадиями развития Е 11.5 и Е 15.5 и поместите их в чашку Петри, содержащую свежую среду. Далее обезглавьте эмбрионы с помощью только что заточенной стерильной вольфрамовой иглы и переложите головы в свежую посуду из предварительно охлажденной среды на льду.
Затем изолируйте мандибулы от головки, поместив иглу в ротовую полость и временно разрезав по направлению к затылку. Храните изолированные мандибулы в предварительно охлажденной среде на льду перед разделкой. Перед тем, как нарезать нижнюю ткань, очистите монтажный диск и лезвие измельчителя тканей 70% этанолом и убедитесь, что лезвие лежит заподлицо с монтажным диском.
Когда он упадет, лезвие необходимо будет заменить после нарезки примерно 200 нижних челюстей, установить расстояние разреза от 200 до 400 микрометров в зависимости от возраста образца, и в зависимости от того, требуется ли целое зачаток зуба для эмбриона E 14.5, где требуется выделение зачатка зуба, используется расстояние разреза 250 микрометров. Далее перенесите нижнюю челюсть на пластиковый монтажный диск и расположите его так, чтобы проявочный язычок находился во фронтальной поперечной ориентации. При рассечении коренных зубов для изоляции резцов делайте сагиттальные срезы через нижнюю челюсть.
После правильной ориентации удалите излишки среды вокруг тканей. С помощью фильтровальной бумаги при этом будет слегка вбиваться нижняя челюсть, фиксируя ее на месте на монтажном диске. Сразу после высыхания фильтровальной бумагой поместите диск на круглый стол из нержавеющей стали измельчителя.
Затем установите усилие лезвия на максимум, включите машину и нажмите «Пуск». Стол автоматически перемещается слева направо, в то время как измельчающая рука, несущая лезвие, поднимается и опускается со скоростью до 200 ударов в минуту. Как только ткань будет полностью нарезана, выключите аппарат.
Убедитесь, что рычаг лезвия находится в поднятом положении, а затем снимите диск. Не подкладывайте пальцы под рычаг лезвия и не оставляйте машину без присмотра. При измельчении ткани возьмите крепежный диск и сразу же добавьте среду к срезам на диске во избежание чрезмерного пересыхания.
Затем аккуратно вытесните ткани среза со дна диска с помощью вольфрамовой иглы или пипетки и поместите их пипеткой в небольшую чашку Петри среднего размера. Затем разделите отдельные срезы с помощью иглы, а затем выберите срезы ткани, содержащие интересующую область под стереомикроскопом. Поместите выбранные срезы в посуду для культуры со свежей, средней, подготовьте металлические сетки для системы культивирования, нарезав полосками, размером четыре сантиметра на 1,5 сантиметра из листов нержавейки полотняного переплетения.
Затем проделайте отверстие в центре с помощью стандартного стационарного дырокола и загните боковые стороны так, чтобы сетка плотно легла поперек центрального колодца и лежала параллельно дну блюда. После того, как решетки будут правильно сформованы, простерилизуйте их в автоклаве перед использованием. Далее подготовьте посуду для культивирования центрального органа колодца, добавив в наружную лунку два миллилитра автоклавной воды для предотвращения обезвоживания.
Затем расположите стерильную металлическую сетку поперек центра чашки. Отрежьте кусок прозрачной полиэтилентерефталатной мембраны с размером пор 0,4 микрометра так, чтобы она была достаточно большой, чтобы закрыть отверстие в сетке. Затем поместите отрезанную мембрану в чашку с выбранным ломтиком нижней челюсти, если требуется прослеживание родословной.
Сначала подготовьте стеклянную капиллярную иглу, протянув стекло игольчатым съемником. Затем сломайте кончик иглы и поместите его кончиком вниз в раствор липофильного красителя, такой как дай глаз или дай о, и наберите немного раствора красителя капиллярным действием. Через несколько минут поместите заполненную иглу в держатель и прикрепите его к ротовому аспиратору.
Расположите кончик иглы в культуральной среде так, чтобы он касался области, которую нужно пометить, например, зубного фолликула, показанного здесь. Затем вытесните небольшое количество красителя на ткань. Затем перенесите срез на предметный столик флуоресцентного микроскопа и убедитесь, что срез успешно помечен.
После успешной маркировки осторожно поднимите ломтик поверх мембраны, а затем перенесите мембрану из среды, прижав ломтик к центру. Затем поместите фильтр на круглое отверстие в центре сетки на приблизительно один миллилитр питательной среды в лунку до тех пор, пока уровень среды не окажется на уровне мембраны. На этом этапе добавьте в среду любые белки или низкомолекулярные ингибиторы.
Кроме того, сфотографируйте срез для записи морфологии в нулевой день с помощью препарирующего микроскопа для лучшей фотографии, рассмотрите срезы с помощью источника света снизу. Поддерживайте посуду во влажной атмосфере с содержанием углекислого газа 5% при температуре 37 градусов Цельсия и меняйте среду каждые два-три дня через равные промежутки времени. Продолжайте визуализировать культуры, чтобы отслеживать прогресс.
Здесь показана серия изображений, документирующих развитие первого молярного зубного фолликула, который помечен флуоресцентным красителем для глаз. Срез представляет собой лобный срез толщиной 250 микрон, отделенный от нижней челюсти мыши в точке E 14,5. Зуб, который обведен черными точками, начинает формироваться на стадии колпачка в нулевой день.
К четвертому дню зубной зачаток достигает стадии колокола, и видно, как клетки зубного фолликула распространяются по дуге вокруг развивающейся внешней эмали. Эпителий После освоения эта техника может быть выполнена за три часа от эмбриона до окончательной культуры. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как успешно визуализировать развитие органов в культуре.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье подробно описан метод культивирования зубных зачатков в срезах нижней челюсти с использованием тканевого чоппера. Этот инновационный подход обеспечивает уникальный доступ к развивающемуся зубу, облегчая проведение манипуляций и отслеживание клеточных линий, что недоступно при использовании традиционных методов культивирования.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология развития
- Методы культивирования тканей
Введение
- Развитие зубов представляет собой сложный процесс, который можно изучать in vitro.
- Традиционные методы культивирования эксплантатов ограничивают возможность наблюдения за развивающимися органами.
- Препарирование нижних челюстей мышиных эмбрионов позволяет получить уникальное представление о развитии зубного зачатка.
- Метод отслеживания клеточных линий необходим для мониторинга перемещения клеток в процессе развития.
Цель исследования
- Наблюдение за развитием зубов в течение нескольких дней в контролируемой среде.
- Совершенствование методов культивирования зубных зачатков.
- Наглядная демонстрация метода для обеспечения более точного воспроизведения.
Используемые методы
- Препарирование нижних челюстей эмбрионов мыши для получения живых срезов.
- Размещение срезов на фильтрах над культуральной средой.
- Инкубация для обеспечения развития зубных зачатков.
- Маркировка срезов трейсерами клеточных линий для отслеживания перемещения клеток.
Основные результаты
- Динамическая природа зубных тканей, наблюдаемая в процессе культивирования.
- Успешное отслеживание перемещения клеток с помощью трекеров клеточных линий.
- Метод демонстрирует преимущества перед традиционным культивированием эксплантатов.
- Визуальная демонстрация способствует лучшему пониманию методики.
Выводы
- Данный метод представляет собой новый подход к изучению развития зубов.
- Он позволяет наблюдать за развивающимися зубными зачатками в режиме реального времени.
- Эта техника может углубить наше понимание динамики зубных тканей.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Метод культивирования срезов позволяет проводить прямое наблюдение за развивающимися зачатками зубов в их естественном тканевом контексте, что способствует механическим исследованиям органогенеза. Этот подход предоставляет исследователям в области биофармацевтики воспроизводимую систему для оценки путей развития и клеточных взаимодействий, имеющих решающее значение для валидации мишеней в регенеративной медицине и терапии челюстно-лицевой области. Благодаря сохранению физиологической архитектуры тканей и темпов развития, данный метод повышает прогностическую достоверность доклинических моделей развития зубов и слюнных желез.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем визуализации морфогенетических движений и динамики клеточных популяций в развивающихся зубных зачатках.
- Операционная ценность: обеспечивает функциональную валидацию мишеней посредством отслеживания линий клеток зубного фолликула и эпителиальных клеток в культуре эксплантатов.
- Прогностическая ценность: способствует снижению механистических рисков, позволяя в режиме реального времени осуществлять мониторинг тканевых взаимодействий между зубными зачатками и окружающими тканями челюсти.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующего тестирования соединений путем поддержания жизнеспособности зачатка зуба и скорости развития, сопоставимых с условиями in vivo.
- Практическая ценность: Стандартизация подготовки срезов с помощью тканевого томильца с заданным расстоянием между разрезами (200–400 μm) для обеспечения воспроизводимости экспериментов.
- Масштабируемость: Возможность повторного использования платформы для различных органов, включая слюнные железы, хрящ Меккеля и носовые железы, что способствует стандартизации анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: Обеспечивает переход от этапа открытия к доклинической валидации путем мониторинга развития от стадии колпачка до стадии колокола в течение нескольких дней культивирования.
- Сопоставление биомаркеров: Поддерживает прослеживание линий с помощью флуоресцентных красителей (например, DiI, DiO) для отслеживания миграции клеток, что позволяет установить корреляцию с трансляционными биомаркерами развития тканей зуба.
- Прогресс с учетом рисков: Предоставляет количественные морфологические показатели (например, стадирование зачатка зуба) для принятия решений о продолжении или прекращении доклинических программ, направленных на изучение развития челюстно-лицевой области.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в континуум процесса разработки — от раннего тестирования гипотез о мишенях до оптимизации соединений-лидеров, в частности для модальностей, направленных на пути развития при регенерации зубов и слюнных желез.
- Биология открытий: способствует уточнению сигнальных путей, позволяя наблюдать за эпителиально-мезенхимальными взаимодействиями и клеточным распространением в процессе созревания зубного зачатка.
- Скрининг: обеспечивает получение готовых к анализу срезов со стабильной жизнеспособностью и синхронностью развития, что облегчает надежную оценку соединений в культуре эксплантатов.
- Аналитика: позволяет получать количественные морфологические и флуоресцентные показатели (например, дугообразное распространение клеток зубного фолликула) для сравнения экспериментальных условий и оценки эффектов соединений.
- Трансляционные исследования: связывает этап ранних открытий с доклинической преемственностью путем моделирования релевантных для человека временных рамок развития на зубных зачатках мышей.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает воспроизводимый рабочий процесс подготовки тканей, применимый к нескольким эктодермальным органам, что сокращает затраты на повторную оптимизацию.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения неопределенности механизмов в исследованиях развития органов.
- Практическая ценность: повышает воспроизводимость результатов благодаря стандартизированным процедурам нарезки, маркировки и культивирования, подкрепленным визуальной демонстрацией.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала, позволяя на ранних этапах снизить риски при работе с мишенями, участвующими в патофизиологии челюстно-лицевой области и слюнных желез.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации доклинических кандидатов с учетом рисков, предоставляя специфические для каждой стадии показатели развития для принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go).
Особенности реализации
- Требуется опыт в диссекции эмбриональных тканей и владение стерильными методами для выделения нижней челюсти из эмбрионов мыши на стадиях E11.5–E15.5.
- Результат зависит от использования тканевого томиграфа с регулируемым усилием лезвия и расстоянием реза (200–400 μm) для обеспечения постоянной толщины срезов.
- Необходима стандартизация доставки трейсеров линий клеток (например, аспирация DiI/DiO с помощью капиллярной иглы) между исследовательскими группами для обеспечения сопоставимой эффективности маркировки.
- Требуется адаптация критериев выбора срезов при работе с различными органами (например, слюнными железами или зачатками зубов) при использовании стереомикроскопа.
- Ограничено необходимостью немедленного нанесения среды после нарезки для предотвращения десикации тканей, что требует четко скоординированного времени выполнения всех этапов работы.
