Экспериментальная модель для изучения Туберкулез-малярией Коинфекция на естественной передачи Микобактерии туберкулеза И Plasmodium berghei

Общая цель этой процедуры заключается в создании экспериментальной модели мыши, которая может быть использована для исследования последствий одновременной инфекции туберкулезом и малярией in vivo. Это достигается в первую очередь путем воздействия на подопытных животных. Туберкулез, содержащий инфекционные аэрозольные капли, с использованием системы ингаляционного воздействия.

На втором этапе поглощение желаемого количества М-туберкулеза проверяется с помощью анализа КОЕ легочной ткани. На следующий день после аэрозольной инфекции, через 40 дней, мыши подвергаются воздействию инфекционных комаров для естественной передачи спорозоитов Plasmodium, которые откладываются под всей кожей во время приема крови. На заключительном этапе контролируется развитие малярийной стадии крови паразита путем анализа пятен гимзы, мазков крови.

В конечном счете, бремя эм туберкулеза в легких и количество паразитов в крови коинфицированных животных могут быть перечислены для определения течения туберкулеза и малярии соответственно. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области туберкулеза, коинфекции малярии, такие как Как коинфекция с малярийным паразитом влияет на патогенез и контроль инфекции микобактерий туберкулеза? Этот протокол был разработан для изучения того, как коинфекция odium buri влияет на хроническую фазу микробийного туберкулеза у иммунокомпетентных мышей C 57 PL six.

Его также можно применять к другим линиям мышей, включая мышей с нокаутом, или использовать с другими видами микобактерий или одиума. Начните с согревания микобактерии туберкулеза. Запасы известного титра КОЕ.

Когда клетки оттают, с помощью одномиллилитрового шприца, оснащенного иглой 27 калибра, тщательно перемешайте суспензию пять раз, чтобы диспергировать бактериальные комки, избегая образования аэрозолей, в зависимости от желаемой дозы инфекции перенесите необходимый объем микобактериального запаса в 50-миллилитровую пробирку, содержащую стерильный PBS, до конечного объема в шесть миллилитров. Затем поместите подопытных животных по отдельности в сетчатые корзины с отсеками. Поместите корзины в круглую аэрозольную камеру и закройте крышку камеры.

Присоедините небулайзер Вентури к трем гнездовым соединениям из нержавеющей стали. Аспирируйте суспензию микобактерий в 10-миллилитровый шприц, снабженный тупой иглой 18 калибра, и перенесите шприц в аэрозольную камеру в закрытом транспортировочном боксе. Теперь снимите колпачок небулайзера и осторожно введите суспензию микобактерий в агрегат.

Следите за тем, чтобы избежать образования аэрозоля. Скиньте шприц в контейнер для острых предметов, содержащий 2% Burton, а затем закройте небулайзер. Запустите ингаляционный аппарат после завершения цикла.

Перед открытием аэрозольной камеры убедитесь, что суспензия микобактерий полностью распылена. Наденьте шлемы для очистки воздуха с электроприводом, затем верните животных в клетки, простерилизуйте корзины с небулайзером и внутри аэрозольной камеры через день после аэрозольной инфекции, поместите назначенных усыпленных контрольных животных на абсорбирующей бумаге на препарирующую доску в шкафу биобезопасности второго класса и продезинфицируйте мышей 70% этанолом для каждой мыши. Сначала сделайте небольшой разрез посередине живота, а затем втяните кожу над головой животного.

Затем с помощью хирургических ножниц вскройте брюшную полость и грудную клетку. Удалите грудную стенку так, чтобы легкие были доступны, а затем удалите их. Перенесите легкие в 15-миллилитровую пробирку с двумя миллилитрами гомогенизационного буфера, а затем используйте поршень от пятимиллилитрового шприца, чтобы процедить ткань через 100-микрометровые сита в маленькую чашку Петри.

С помощью одномиллилитровой пипетки, оснащенной барьерным наконечником, несколько раз промойте сито, а затем распределите около 250 микролитров гомогената легких по восьми агаровым пластинам. Используйте одноразовые разбрасыватели для тщательной тарелки образцов, когда пластины высохнут. Запечатайте каждую пластину перфилом.

Заверните их в алюминиевую фольгу и выдерживайте в вертикальном положении при температуре 37 градусов Цельсия не менее четырех недель. Чтобы заразить наивных мышей, инфицированных микобактериями, малярией через укусы комаров, поместите обезболенных животных на сетку клеток для комаров, позволяя инфицированным комарам проникать через мембрану, чтобы обеспечить успешную передачу спорозоитов. Оставьте мышей в клетках на 10 – 15 минут.

Перенесите мышей обратно в клетки на бумажное полотенце и накройте их бумажным полотенцем, чтобы они согрелись, пока не проснутся от анестезии. Убейте комаров, распылив на них 70% этанол или другие дезинфицирующие средства через сетку клетки, и простерилизуйте клетки путем автоклавирования. Чтобы следить за пара, с помощью иглы прокалывают самый конец вены каждого зараженного животного и собирают одну каплю крови.

С каждого конца предметного стекла используйте еще одно предметное стекло, чтобы вытянуть по одной капле крови на половину длины нижнего предметного стекла. Затем переверните раскидную горку и используйте другой край для второго мазка. Поместите предметные стекла в решетку для окрашивания.

Кратковременно зафиксируйте мазки крови в абсолютном метаноле, а затем высушите на воздухе. Далее на горки погружаем мазки в Гизу. Через 10 минут несколько раз опустите предметные стекла в окрашивающие вены, наполненные деионизированной водой, чтобы смыть излишки пятна.

Наконец, высушите слайды на воздухе в вертикальном положении. Индуцированное спорозоитом заражение экспериментальных животных укусами комаров приводит к 100%-ному уровню заражения, что подтверждается присутствием паразитов на стадии крови через четыре-пять дней. Как показано в таблице, инфицирование как наивных, так и инфицированных m туберкулезом мышей Plasmodium buri через укусы комаров приводит к последовательному и воспроизводимому заражению всех животных в экспериментальной группе.

Сравнивая мышей с предварительной проходимостью и мышей в контрольной группе с мышами и мышами, инфицированными микобактериями туберкулеза, можно заметить, что предварительная проходимость немного задерживается. У мышей, которые были предварительно инфицированы микобактерией туберкулеза, у мышей с микобактериями туберкулеза с использованием системы ингаляционного воздействия приводит к успешному осаждению бактерий в легкие животного с относительно низкой вариабельностью между отдельными мышами. Микобактериальная нагрузка в легких инфицированных мышей C 57 black six увеличивается в присутствии P. burga.

Напротив, мыши-коинфицированные мыши имеют меньшую пара-эмию по сравнению с мышами-одиночными инфицированными плазмодиями. После этой процедуры могут быть выполнены такие методы, как проточная цитометрия, ПЦР Элиза или гистологические методы на тканях или жидкостях организма, представляющих интерес, для анализа одновременно возникающих иммунных реакций против мальчатых паразитов и туберкулярных основ и их взаимодействий в коинфицированном хозяине. Не стоит забывать, что работа с возбудителем человека микробактерией туберкулеза может быть крайне опасной и следует принимать меры для того, чтобы всегда избегать контакта с инфекционными аэрозолями.

Все экспериментальные работы, связанные с микробактериями туберкулеза, должны проводиться в помещениях соответствующего третьего уровня биобезопасности.