Производство и очистка нерепликативной собак аденовируса типа 2 Производные векторов

За последние 15 лет векторы, полученные от собачьего аденовируса типа 2 (CAV2), доказали свою эффективность для трансдукции клеток in vitro и in vivo и широко используются для вакцинации и генной терапии. В этой статье мы опишем процедуру создания, получения и очистки векторов CAV2, приводящих к образованию вирусных суспензий с высоким титром.

Общая цель этой процедуры заключается в создании, получении и очистке векторов аденовируса собак второго типа. Это достигается путем предварительного клонирования интересующего гена в челночную плазмиду. Вторым этапом является получение рекомбинантной геномной плазмиды путем гомологичной рекомбинации.

Затем у рекомбинантного дефектного теленка два вируса продуцируются и амплифицируются в транскомплементарной клеточной линии. Заключительным этапом является очистка и концентрация полученного рекомбинантного вируса для различных применений in vivo и in vitro. В конечном счете, иммунофлуоресцентная конфокальная микроскопия используется для демонстрации примеров вирусной трансдукции в мозге грызунов.

Основное преимущество этих методов по сравнению с существующими методами, такими как векторы, полученные из невроза человека, заключается в том, что в человеческих популяциях отсутствует ранее существовавший иммунитет против детеныша два. Таким образом, этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области вакцинации или генной терапии, такие как оценка роли белков, экспрессируемых в определенных областях мозга. Таким образом, демонстрацией этой процедуры будут май Кей Кей и Корин Бержерон.

Двое исследователей из наших лабораторий готовятся к этой процедуре за день до трансфекции путем посева одной клетки DKE на шестилуночный планшет выращивают клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 в DMEM с высоким содержанием глюкозы, содержащей 7% тепла, инактивированного эмбрионального теленка, сывороточный натрий, пируват, пенициллин и стрептомицин. На следующий день клетки должны быть на 70-80% слитыми для трансфекции переварить два микрограмма pcal GOI рекомбинантной cav two геномной плазмиды с ASC одной, чтобы высвободить невирусную последовательность плазмиды, проверить полученный паттерн рестрикции на 0,8%. Смешайте переваренную ДНК с 200 микролитрами струйного первичного буфера и сделайте вихрь в течение 10 секунд.

Добавьте четыре микролитра струйного грунта и перемешайте, вортексируя в течение 10 секунд. Коротко открутите, чтобы удалить капли, и выдержите 10 минут. При комнатной температуре добавьте трансфекционную смесь по каплям на ячейки DKE One.

Аккуратно встряхните тарелку, чтобы равномерно распределить смесь и выдерживать при температуре 37 градусов Цельсия. Через неделю после трансфекции соберите клетки и питательную среду в полипропиленовую пробирку объемом 15 миллилитров. Разрушайте клетки с помощью трех циклов замирания.

Очистите лизат центрифугированием в течение 10 минут при 1,800 °G. Соберите надосадочную жидкость и храните при температуре минус 20 для последующего размножения вируса, чтобы вирус инфицировал от 80 до 90% сливающегося монослоя DKE One, выращенного в одной лунке шестилуночного планшета с 0,5 миллилитрами вируссодержащей надосадочной жидкости. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа при слабом перемешивании. Удалите инокулюм и замените его 1,5 миллилитрами полного DMEM, содержащего 5% инактивированных температурой клеток FCS при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех-четырех дней.

Клетки следует ежедневно контролировать на предмет появления цитопатического эффекта или CPE. Если не видно четкого CPE. Соберите клетки после четырех дней культивирования и повторите вирусную амплификацию, когда чистый CPE повлияет на большинство клеток.

Обычно после двух-четырех раундов вирусной амплификации собирают клетки с питательной средой и замораживают размораживание три раза, как было показано ранее. Заражайте от 80 до 90% конфлюента. DKE одну клетку выращивали в трех чашках для культуры тканей диаметром 10 сантиметров с использованием 1,5 миллилитров вирусосодержащей надосадочной жидкости на чашку через три-четыре дня после завершения CPE.

Соберите клетки из этих чашек диаметром 10 сантиметров, нарушите их на три цикла фристайла и очистите лизат центрифугированием в течение 10 минут в 1 800 раз. G соберите надосадочную жидкость и храните при температуре минус 20 для крупномасштабной амплификации Cav два, чтобы начать процедуру масштабирования, инфицируйте от 80 до 90% сливающихся монослоев DKE, одну клетку, выращенных в 40 чашках для культуры тканей диаметром 10 сантиметров для каждой чашки, используйте 0,1 миллилитра вируссодержащего надосадочную жидкость, разведенную в одном миллилитре полного DMEM без FCS, инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех-четырех часов при слабом перемешивании. Через три-четыре часа добавьте пять миллилитров полного DMEM с добавлением 5% FCS и выдерживайте в течение трех дней.

Через три дня соберите зараженные клетки из 40 10-сантиметровых тарелок в 50-миллилитровые полипропиленовые пробирки, гранулированные клетки при 1,200 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Резус-суспендия в 15 миллилитрах среды DMEM разрушает клетки в течение трех циклов замораживания-оттаивания. Удалите клеточный мусор центрифугированием при 1,800 G в течение 10 минут.

Храните надосадочную жидкость при температуре минус 20 до очистки вирусных частиц для очистки вирусных частиц. Приготовьте прерывистый градиент хлорида цезия в 14-миллилитровой пробирке UltraClear. Сначала налейте на дно пробирки два миллилитра раствора хлорида цезия высокой плотности.

Затем медленно добавьте два миллилитра раствора хлорида цезия более низкой плотности поверх первого раствора. Осторожно загрузите вирусный надосадочный слой поверх градиента хлорида цезия. Заполните пробирку минеральным маслом на расстоянии до двух-трех миллиметров от верхней центрифуги в качающемся роторе SW 40 в течение одного часа и 30 минут при 130 000 умноженных на g и 18 градусах Цельсия после центрифугирования.

Две белые полосы хорошо видны на границе раздела между двумя слоями раствора хлорида цезия. С помощью иглы 21 калибра и шприца соберите путем бокового прокола нижнюю полосу, содержащую зрелые cav две частицы. Старайтесь, насколько это возможно, избегать скопления верхней полосы, которая соответствует пустым вирусным частицам.

Приготовьте непрерывный градиент хлорида цезия в прозрачной пробирке объемом 14 миллилитров, смешав коллективные вирусные частицы с раствором хлорида цезия. Заполните пробирку минеральным маслом на расстоянии до двух-трех миллиметров от верхней центрифуги в качающемся роторе SW 40 в течение 18 часов при 130 000 перегрузках и 18 градусах. После центрифугирования соберите двух белых теленков, содержащих ленту, боковым проколом с помощью шприца, как показано ранее.

Опять же, старайтесь избегать сбора оставшейся верхней полосы. Это должно быть легче в этом непрерывном градиенте, который лучше разделяет две полосы. Общий объем собранной суспензии не должен превышать двух миллилитров.

Далее уравновесьте цидекс G 25 PD 10 в колонке с 30 миллилитрами PBS. Загрузите вирусную суспензию на колонку и отбросьте поток через элюирование с 500 микролитровыми фракциями PBS, соберите фракции пять-семь, которые обычно содержат обессоленные cav двух частиц. Вирус, содержащий фракции, можно легко идентифицировать, потому что там аромат благословенный.

Наконец, добавьте 150 микролитров глицерина к 1,5 миллилитрам суспензии CAV 2 и храните в Eloqua при температуре минус 80 градусов Цельсия для титрования cav two путем конечного разведения, разморозьте аликвоту очищенного вируса на льду и выполните десятикратное серийное разведение в диапазоне от 10 до минус 2 до 10 до минус 12 в сыворотке крови DMEM. Добавьте по 50 микролитров каждого вирусного разведения в пять лунок 96-луночного планшета, добавьте 1,5 раза по 10 к четвертому DKE, по одной клетке в каждую лунку, инкубируйте планшет при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 в течение пяти дней на пятый день. Постинфекционный мониторинг появления ЦПД под микроскопом.

Инфекционные титры определяют как медиану инфекционных доз культуры тканей с использованием статистического метода Рида и Мен до получения вирусных векторов. Рекомбинантный CAV с двумя геномами, несущий экспрессирующую кассету для трансгена, конструируется с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Во-первых, представляющий интерес ген клонируют в челночную плазмиду в виде экспрессионной кассеты с ранним промотором цитомегаловируса и сигналом полиаденилирования, окруженным двумя CAV двумя производными геномными последовательностями, представляющими восходящие и нисходящие рекомбинационные последовательности-мишени.

На втором этапе экспрессионная кассета вставляется из челночной плазмиды в второй геном CAV путем гомологичной рекомбинации. Вставка кассеты с экспрессией GOI приведет к делеции EA и части гена E one B в рекомбинантном геноме. После получения рекомбинантной геномной плазмиды вирусные частицы получают с использованием CAV two E one, дополняющих клетки DKE One.

Явный цитопатический эффект, обусловленный большим количеством вирусных частиц, образующихся в инфицированных клетках, может быть легко визуализирован с помощью светлопольной микроскопии или экспрессии трансгенов. В этом примере GFP выражает CAV два вектора. После нескольких раундов вирусной амплификации с использованием свежих клеток DKE One вирусные частицы очищают ультрацентрифугированием на градиентах хлорида цезия.

Концентрированные вирусные частицы проявляются в виде двух опалесцирующих полос в градиенте цезия. Нижняя полоса соответствует зрелым рекомбинантным cav two, которые должны быть собраны. В то время как верхняя полоса содержит пустые неинфекционные частицы, которых следует избегать.

Полученный рекомбинантный вектор теленка два может быть использован для трансдукции практически всех типов клеток у самых разных видов, как in vitro, так и in vivo. Здесь показан один из примеров применения, в котором GFP, экспрессирующий CAV 2, был введен с помощью стереотаксиуса в различные области центральной нервной системы мыши. Поскольку этот протокол обеспечивает высокий титр и чистоту, инъекция всего одного микролитра разбавленного GFP PBS, экспрессирующего два вектора CAV в зубчатой извилине или DG, приводит к 40-50% нейрональной трансдукции.

Более того, благодаря способности С-2 ретроградно транспортироваться в аксонах, инъекция двух микролитров разбавленного PBS GFP, экспрессирующего CAV два вектора в стриатуме, позволяет трансдукцию почти 80% нейронов nigro stri AAL в субмаринах, nigra pars compacta после его развития. Эти методы открывают путь исследователям в области вакцинологии или нейронаук для изучения новых антигенов и функций генов в мозге во многих разнообразных моделях животных. Поэтому не забывайте, что работа с двумя производными векторами CAF может быть чрезвычайно опасной и предупредительной, такие как надлежащие меры локализации и обращения с отходами, включая средства индивидуальной защиты и работу в вытяжных шкафах с ламинарным потоком в BSL.