Анализируя Динамика белков с использованием водорода валютный масс-спектрометрии

Общая цель данного эксперимента заключается в анализе подтверждающей гибкости белков и ее изменений в ответ на взаимодействие с окружающей средой, лигандом или белковыми взаимодействиями. Это достигается путем предварительной инкубации интересующего белка в различных условиях, которые, как предполагается, влияют на подтверждение белка, таких как связывание лиганда. Затем реакционную смесь разбавляют в оксид дейтерия, инкубируют в течение различных временных интервалов, а затем анализируют с помощью масс-спектрометрии жидкостной хроматографии для определения степени встраивания дейтеропласта в пептидный остов

Амидные группы, поскольку на охраняемых территориях уменьшилось включение вторичков, сравнение пептидных спектров эксперимента при отсутствии и наличии партнера по связыванию выявляет смещение OID спектров из-за разницы в весе между протоном и дейтроном. Области, которые демонстрируют выраженную защиту после добавления партнера по связыванию, являются потенциальными сайтами связывания. В зависимости от покрытия последовательностей и наличия перекрывающихся пептидов, сайты связывания могут быть сужены до нескольких аминокислот.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области сворачивания белка и динамики белка, например, как сворачиваются белки, как они разворачиваются, как они реагируют на физические и химические воздействия, такие как повышение температуры или тяжелые металлы. Как подобное связывание и белок-белковые взаимодействия могут влиять на подтверждение белка. Это также очень важно для разработки белковых препаратов, для проверки правильности сворачивания и для общего контроля качества.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, могут столкнуться с рядом трудностей. Если белок, например, плохо усваивается пепсином, покрытие последовательности будет низким. Если белок очень склонен к агрегации, он может агрегировать во время инкубации или после добавления буфера для гашения, что приведет к низкой интенсивности сигнала в масс-спектрометре.

В этой демонстрации мы исследуем связывание молекулярного шаперона дрожжей HP 90 с его cos chaperone Sty one с помощью масс-спектрометрии обмена водорода STY one связывается с HP 90 и облегчает связывание клиента путем ингибирования активности ABA HB ninety. Начните эту процедуру с подготовки буферов, образцов и шариков, как подробно описано в текстовом протоколе. Чтобы подготовить колонны к замене амидного водорода, открутите одну сторону защитной колонны и плотно снимите фильтр.

Накрутите уплотнительную воронку на открытый конец колонны. Используйте адаптер 16-го дюйма, чтобы прикрепить пустой пятимиллилитровый шприц к нижнему выпускному отверстию колонки. Убедитесь, что он плотно прикреплен к защитной колонне

Нанесите несколько капель навозной жижей на верхнюю часть воронки. Потяните за поршень шприца, чтобы отсосать кашу через воронку в защитную колонну. Нанесите на воронку еще суспензионный материал и продолжайте процедуру до тех пор, пока защитная колонна не будет полностью заполнена бортовым материалом.

Затем снимите воронку перед тем, как плотно установить фильтр и фильтрующее кольцо на открытый конец. Накрутите колпачок колонки на защитную колонну и снимите шприц с другой стороны. Закройте оба конца защитных колонок заглушками.

Во избежание пересыхания материала колонны необходимо настроить систему для проведения водородообменной масс-спектрометрии. Сначала подключите колонку ловушки к высокопроизводительной системе жидкостной хроматографии или ВЭЖХ. Уравновесьте колонну, установив расход насоса A на 0,4 миллилитра в минуту с 0,1% муравьиной кислотой в качестве растворителя.

После калибровки масс-спектрометра подключите выходное отверстие ВЭЖХ к источнику масс-спектрометра. Чтобы сначала определить пептические пептиды, подключите к системе колонку с пепином, а затем аналитическую колонку. Настройте параметры для хроматографии и масс-спектрометрии в управляющем программном обеспечении, выбрав градиентный тип и метод масс-спектрометрии.

Выберите длинный градиент, чтобы обеспечить хорошее хроматографическое разрешение. Включите тандемные масс-спектры на масс-спектрометре. Приготовьте от 100 до 200 помо белка теплового шока 90 или HSP 90 в 100 микролитрах буфера H два л.

Добавьте 100 микролитров буфера для закалки и перемешайте, пипетируя вверх и вниз. Введите образец объемом 200 микролитров в отверстие для инъекций инъекционного клапана с помощью шприца Hamilton. Переведите инъекционный клапан в положение для инъекции и запустите программу хроматографии.

Затем определите пептиды белка теплового шока 90 путем поиска полученных пептидов в базе данных. Уменьшите температуру системы до нуля градусов по Цельсию, добавив ледяную воду. Повторите этот шаг без тандемной масс-спектрометрии и с градиентом, который будет использоваться для реального эксперимента по обмену водорода.

Для белка теплового шока 90 и белка ИППП 1 используют 10-минутный градиент от 90% растворителя, 10% растворителя B до 45% растворителя A 55% растворителя B, определяют время удержания идентифицированных пептических пептидов в используемом градиенте и создают список, включающий пептидную последовательность, заряд пептида, состояние и время удержания. Это будет использоваться для идентификации каждого пептида после экспериментов по обмену водорода. Чтобы определить границы взаимодействия белковых белков, сначала настройте метод градиентной и масс-спектрометрии.

В управляющем программном обеспечении используйте 10-минутный линейный градиент от 90% растворителя, 10% растворителя B до 45% растворителя. Масс-спектрометрический метод с 55% содержанием растворителя B оптимизирован для обнаружения в диапазоне от 300 до 1500 масс к заряду, хотя большинство пептидов будут ниже 1000 масс к заряду. Установите инжекторный клапан в нагрузочное положение и шестипортовый клапан.

В положении обессоливания загрузки установите расход загрузочного насоса на 0,4 миллилитра в минуту. После запуска неизмененного эталона и 100% контрольного образца, как описано в текстовом протоколе, приготовьте от 20 до 100 пико-моль белка теплового шока 90 в объеме от одного до пяти микролитров. Добавьте буфер из оксида дейтерия с регулируемой температурой, чтобы довести объем образца до 100 микролитров для инкубации в течение точного периода времени, который был ранее определен, как описано в текстовом протоколе.

При определении динамического диапазона обмена, затем добавьте 100 микролитров ледяного топлива, закалите буфер и пипеткой вверх и вниз два раза быстро введите 200 микролитров в инжекционный клапан ВЭЖХ. Переключите инъекционный клапан в положение для инъекции и немедленно начните программу хроматографии. Через две минуты переключите шестилинейный клапан из положения загрузки соли в положение элюирования.

Проделайте это для каждого белка в отдельности для определения включения дейтронов в каждый пептид в отсутствие взаимодействующего белка, для определения взаимодействия поверхности смеси белка теплового шока 90 с не менее чем двукратным превышением ИППП одного, чтобы сдвинуть равновесие в связанное состояние, инкубировать при требуемой температуре до тех пор, пока образование комплекса не придет в равновесие. После инкубации добавьте буфер из оксида дейтерия с регулируемой температурой, чтобы довести объем образца до 100 микролитров, и инкубируйте в течение точно определенного периода времени. Затем добавьте 100 микролитров ледяного буфера для гашения, и пипеткой вверх и вниз два раза быстро введите белок и бегите, как раньше.

Проанализируйте полученные данные с помощью подходящего программного обеспечения и используйте определенное время хранения, чтобы найти каждый пептид в анализе. Рассчитайте OID распределения изотопов для неизмененного белка и для экспериментов по обмену водорода, сравните включение дейтеро только целевого белка и с избытком связывающего партнера. Это может быть сделано автоматически с помощью коммерческого программного обеспечения или вручную с помощью программы для работы с электронными таблицами M, прямое взаимодействие белка между HS P 90 и STI one было проверено путем сравнения спектров пептида STI One в отсутствие и присутствие HS P 90 после мечения оксидом дейтерия.

Полученный график различий показывает, что в основном пептиды в TPR 2 A и TPR 2 B демонстрируют сильную защиту в присутствии HS P 90, что указывает на то, что эти области взаимодействуют с HS P 90. Защита в TPR two A может быть легко рационализирована по кристаллической структуре STY one TPR two A TPR two B в комплексе с пептидом HS P 90, который окрашен в соответствии с количеством амилоидных протонов, защищенных от включения DEUTERO. Столь явная защита при белковых взаимодействиях наблюдается далеко не всегда.

Защита в HSP 90 при наличии ИППП не так выражена и локализована, как при ИППП. Все пептиды демонстрируют несколько повышенную защиту от включения дейтеро. Здесь показано мультяшное изображение дрожжей HS P 90, окрашенных в соответствии с количеством протонов амли, защищенных от включения дейтронов, STY one стабилизирует HS P 90 глобально, поскольку ни одна область белка не проявляет большей гибкости в его присутствии.

Неясно, происходит ли это уменьшенное включение дейтронов в результате прямого взаимодействия с одним из них или через аллостерические эффекты. При подтверждении HSP 90 с помощью непрерывного мечения, водородного обмена, масс-спектрометрии изучали динамику различных белковых участков. Здесь показаны спектры пептидов с 43 по 62 из нуклеотидсвязывающего домена HSP 90.

В присутствии и отсутствии ИППП спектры пептидов демонстрируют зависящее от времени включение дейтерия, которое увеличивается при более длительной инкубации. Степень защиты меняется на протяжении всего периода инкубации, демонстрируя большую разницу при более коротком времени инкубации и почти одинаковые обменные курсы в самый длительный момент времени. Это говорит о более низкой степени стабилизации или области динамических взаимодействий с частыми диссоциациями и ассоциациями.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что условия должны быть скрупулезно постоянными и иметь все наготове до начала реакции обмена. После этой процедуры можно использовать другие методы для ответа на дополнительные вопросы, такие как расположение сайтов взаимодействия в белковых комплексах.