Использование Caenorhabditis elegans в качестве модельной системы для изучения белкового гомеостаза в многоклеточном организме

Общая цель следующих экспериментов с генетически податливыми многоклеточными CENO R elegance состоит в том, чтобы отслеживать неправильное сворачивание белка на трех уровнях: организм, клетки и белки. Поведенческие фенотипы, такие как подвижность или термоустойчивость, функционируют как индикаторы изменений в белковом гомеостазе на уровне организма, чувствительных к температуре или происходящих в природе. Метастабильные белки используются для следования за неправильной локализацией белка, которая может быть связана с неправильной локализацией белка.

Анализ частичного переваривания ex vivo напрямую контролирует стабильность белка. Результаты могут показать изменения способности к протеостазу при различных температурах культивирования на основе анализа терморезистентности, иммунофлуоресцентной микроскопии и западного анализа крови. Эти процедуры будут продемонстрированы аспирантами в моей лаборатории.

Поведенческий анализ будет продемонстрирован иш идо, и Шай продемонстрирует иммуноокрашивание и заваливание АНА, а Шерон продемонстрирует частичное переваривание. Этот протокол измерения температурного допуска сопровождается подготовительными этапами для синхронизации животных и анализом движений. Оба описания в текстовом протоколе начинаются со сбора репликатов, содержащих не менее 20 синхронизированных животных.

В 24 хорошо отработанных лунках, содержащих 450 микролитров буфера теплового шока. Дополните каждую лунку девятью микролитрами цитоксина. Теперь переложите тарелку в разогретую ванну.

Тепловой шок, температура и продолжительность сильно зависят от условий произрастания. В частности, температура культивирования оценивает выживаемость животного путем мониторинга поглощения ими матрицы. При использовании флуоресцентного стереоскопа с фильтром TXR животные, которые берут кубик, мертвы.

Основным преимуществом данной методики по сравнению с существующими методами, такими как подсчет кинов, является использование визуального считывания смертности животных, что делает данное сочинение намного быстрее и воспроизводимее. На требуемом этапе пересадите не менее 30 животных в микроцентрифужную пробирку, содержащую буфер М-9. Вымойте животных несколько раз с помощью М девять, выполняя короткие шаги центрифугирования на низкой скорости, и подвешивайте их в М девять.

Затем поместите трубочки на лед на несколько минут, чтобы они остыли. После охлаждения удалите лишнюю жидкость и инкубируйте трубки. В 500 микролитрах ледяного 4%ПАРАФОРМА альдегида.

Время инкубации должно быть откалибровано для каждого исследуемого белка и должно составлять от пяти до 30 минут при комнатной температуре. Теперь трижды вымойте неподвижных животных с помощью PBS tween при pH 7,2 путем центрифугирования. Центрифугирование всегда выполняется при 3000 об/мин в течение одной или двух минут, если не указано иное.

В капюшоне удалите большую часть надосадочной жидкости и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре пучка раствора меркаптоэтанола. Затем инкубируйте животных при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи с легким покачиванием на следующий день в капоте. Вымойте животных три раза с помощью PBST центрифугированием и Resus.

В конце промывки добавьте от 50 до 100 микролитров PBST и удалите большую часть этого PBST после еще одного центрифугирования. Далее добавьте от 100 до 150 микролитров раствора коллагеназы и инкубируйте животных при температуре 37 градусов Цельсия при сильном перемешивании. Используйте термомиксер или встряхивающий инкубатор.

Через пять минут приступайте к периодическим проверкам под стереомикроскопом. Когда пятая часть животных сломается, остановите реакцию, поместив трубку на лед. Этот шаг очень чувствителен.

Продолжительность лечения зависит от условий фиксации и может сильно варьироваться от штамма к штамму. Длительная инкубация может привести к полной деградации животных. Условия должны быть откалиброваны перед каждой партией ферментов, а деградация должна тщательно контролироваться.

Далее дважды вымойте животных в ПБСТ. Соберите животных центрифугированием и удалите большую часть PBST. Затем добавьте один миллилитр раствора БА с последующей инкубацией с легким покачиванием в течение часа при комнатной температуре, соберите животных центрифугированием и повторно суспендируйте их в 200 микролитрах А. Теперь добавьте первичное антитело и начните ночную инкубацию с легким покачиванием при комнатной температуре.

Эти параметры действительно нуждаются в калибровке. Далее вымойте животных методом центрифугирования. Повторно суспендируйте их в миллилитрах b, a и инкубируйте их при осторожном перемешивании от 15 минут до часа при комнатной температуре.

На этом этапе может быть добавлено необязательное добавление флуоресцентного красителя. Затем повторите промывку буфером BA еще три раза и завершите промывку с помощью Resus, суспендируя 100 микролитров BA с соответствующими флуоресцентно помеченными вторичными антителами в разведении от одного до 100. Инкубируйте образцы с укачиванием в течение нескольких часов при комнатной температуре, защищенной от света, чтобы очистить вторичную обмотку.

Выполните три промывки с a, b, a. Затем закрепите животных на предметных стеклах сначала с помощью Резуса, подвесив их в 10 микролитрах а, а, а затем с помощью пипетки с широким отверстием перенесите один или два микролитра образца на каждое предметное стекло, добавьте равный объем монтажной среды и накройте предметное стекло. Аккуратно заклейте горку лаком для ногтей.

Предметные стекла можно хранить при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение длительного времени. Как правило, новички в этом протоколе будут испытывать трудности, потому что протокол длинный и включает в себя множество шагов, которые могут повлиять на его эффективность, что затрудняет устранение неполадок. Начните со сбора животных примерно из 1560-миллиметровых пластин в один или два миллилитра буфера М-9.

Животные не должны быть переполнены. Вымойте животных несколько раз с помощью буфера M nine, центрифугируя и подвешивая животных. После финального отжима ресуссорят животных в 100 микролитрах М девяти буфера.

Затем заморозьте животных и с помощью охлажденного пестика и дрели измельчите образец, находясь на льду. Часто останавливается, чтобы проверить, достаточно ли измельчены животные. После того, как животные будут полностью измельчены, оцените объем экстракта червей.

Затем добавьте в равный объем два х раствора для лизиса червей и инкубируйте образец на льду в течение 15 минут. Затем удалите мусор с помощью охлажденного цикла центрифугирования и перенесите надосадочную жидкость в чистую микропробирку. После анализа по Брэдфорду разбавьте образец до 3-3,5 миллиграммов белка на миллилитр.

Затем добавьте свежеприготовленный охлажденный раствор трипсина камуфляжа в соотношении один к 1200. На этом этапе установите образец на инкубацию в течение часа. Во время инкубации периодически берите 20 микролитров аликвот и сразу же смешивайте их с буфером SDS, а затем в течение пяти минут при температуре 96 градусов Цельсия.

Выведите образцы и проведите анализ западной крови, чтобы определить относительную стабильность белка. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что не следует добавлять коктейль ингибиторов протеазы в образец пищевого продукта, а вместо этого мы быстро и будем держать образцы на льду. Мутация E 781 K ts в мышечном шапероне на 45 сильно влияет на сворачивание и сборку миозина и, следовательно, влияет на подвижность животных.

Когда эти мутанты выращивались при температуре выше 20 градусов по Цельсию, они были полностью парализованы, но не при 15 градусах по Цельсию. Когда дикие животные, выращенные при температуре 25 градусов по Цельсию, подверглись длительному тепловому шоку, большинство из них выжило. В то время как только 30% выживают при выращивании при температуре от 15 до 20 градусов Цельсия для мониторинга эффективных модификаторов реакции на тепловой шок, условия контрольного стресса были повышены до 70% выживаемости для диких животных.

Животные подвергались воздействию теплового шока с температурой 37 градусов по Цельсию в течение шести часов. В первый день взрослой жизни выживаемость оценивалась с помощью анализа на поглощение оранжевого цита. Мертвые животные обозначены белыми стрелками, а живые животные – желтыми стрелками.

Локализацию нескольких метастабильных белков визуализировали с помощью специфических антител. Например, в рестриктивных условиях параметры ошибочно локализуются в поликристаллических сборках, а не в мышечном саркомере. Аналогичным образом, миозин TS образует дезорганизованные филаменты вместо высокоупорядоченных нитевидных структур при рестриктивной температуре.

Животные, экспрессирующие различные мутантные белки TS, экспрессируемые совместно с мио три. GFP показал быстрое ухудшение организации миофиламентов, что было обнаружено при мониторинге изменений GFP в миозине, подтверждение может отражать изменения в способности мышечных клеток к сворачиванию. Протеолитический характер фрагментации тяжелой цепи миозина, экспрессируемой совместно с UNC 45 Ts, демонстрирует отличные характеристики по сравнению с профилем пищеварения миозина у диких животных, что подтверждает утверждение о том, что на сворачивание миозина влияет UNC 45.

Потеря функции. Хотя этот метод может дать представление о регуляции протеостаза в морской элегантности, он также может быть применен в других системах, таких как различные модельные организмы.