FtsZ полимеризации Анализы: Простые протоколы и соображения

Общая цель данного эксперимента заключается в определении подходящих условий для изучения FTSZ, полимеризации и активности с использованием простых анализов и оборудования. Это достигается путем проведения анализов осаждения полимеров FDSC в различных условиях для поиска подходящих условий для полимеризации FDSZ. В качестве второго шага мы проводим анализы рассеяния света для изучения полимеризации FDSZ в режиме реального времени.

Далее мы проводим анализ гидролиза ГТФ для определения связанной с полимеризацией активности г гтфа FT SC. Получены результаты, показывающие, какие условия лучше всего подходят для изучения FTSC конкретного бактериального источника на основе седиментации, рассеяния света и гидролиза ГТФ. Показанная здесь методика проста в выполнении в любой лаборатории и позволит быстро получить представление о возможностях полимеризации конкретного FT a z. Мы считаем, что выбор правильного буфера особенно важен при работе с FTAZ в присутствии других белков, демонстрирующих методику EVA кроля, — это аспирант из моей лаборатории.

Для начала добавьте пять микролитров 100 миллимолярного хлорида магния и 12 микролитров бактериальных белков, FDSC и/или SEP F в один из выбранных полимеризационных буферов, которые имеют различные значения pH и состав, как описано в прилагаемом текстовом протоколе. Далее поместите пробирки в инкубатор с функцией встряхивания и инкубируйте образцы в течение двух минут при температуре 30 градусов Цельсия и 300 оборотах в минуту. После того, как пробирки будут тщательно перемешаны, начните полимеризацию, добавив один микролитр смеси GTP или GDP из 100 миллимолярного исходного раствора так, чтобы конечная концентрация составила два миллимоляра.

Затем поместите образцы обратно в инкубатор для встряхивания еще на 20 минут. Затем вращайте трубки при комнатной температуре в течение 15 минут при 20 000 об/мин с помощью ротора TLA 55 или эквивалентного ротора 24 600 G, если вы используете что-то другое. После того, как центрифуга закончит работу, переложите надосадочную жидкость в чистые пробирки и сохраните гранулы на потом.

Возьмите 20 микролитров перенесенной надосадочной жидкости и смешайте их в отдельной пробирке с 20 микролитрами двукратно концентрированного буфера для пробы. Закройте крышки и кипятите образцы в течение 10 минут при температуре 98 градусов Цельсия. Далее добавьте 50 микролитров двукратно концентрированного буфера для образца в каждую предварительно отложенную фракцию гранул и суспензируйте полимеры, прокипятив образцы в течение 10 минут при температуре 98 градусов Цельсия.

После того, как образцы закончат кипение, добавьте еще 50 микролитров деминерализованной воды в пробирки, содержащие гранулы. Затем загрузите по 10 микролитров надосадочной жидкости и гранул из каждого образца рядом друг с другом на 10%-ный гель SDS и запустите гель при напряжении 150 вольт. Как только гель будет готов, удалите гель и покрасьте его кумаси бриллиантовым синим G two 50.

Затем визуализируйте гель и количественно оцените белок с помощью цитометрии, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Сначала включите флуоресцентный спектрометр и дайте лампе прогреться в течение нескольких минут, чтобы избежать тепловых колебаний. Кроме того, включите циркуляционную водяную баню и установите температуру воды на уровне 30 градусов по Цельсию, чтобы поддерживать постоянную температуру в камере вете.

По мере прогрева системы определите рабочие параметры спектрометра. Установите высокое напряжение детектора на 300 вольт, а длины волн излучения и возбуждения на 350 нанометров с шириной щели четыре нанометра. Затем запрограммируйте протокол сбора данных, выбрав сбор данных на основе времени продолжительностью 3 600 секунд.

Тщательно очистите флуоресцентную вету объемом 200 микролитров с длиной пути один сантиметр, сварив ее в чистящем растворе на водяной бане в течение пяти минут. Затем приготовьте 294 микролитра мастер-смеси для каждого из девяти полимеризационных буферов, описанных в сопроводительном текстовом протоколе, каждый из которых содержит 10 миллимолярных хлоридов магния и 12 микромолярных FDSE в качестве конечных концентраций, рассчитанных для 300 микролитров. Затем кратковременно вихревыми смесями передают ветеринару 196 микролитров первого полимеризационного буфера.

Поместите его в спектрометр и инкубируйте в течение двух минут, чтобы довести температуру образца до 30 градусов по Цельсию. Через две минуты начните сбор данных и подождите 90 секунд, чтобы убедиться, что сигнал стабилен. Затем добавьте четыре микролитра 100 миллимолярных ГТФ или ВВП.

Перемешайте образец и продолжайте сбор данных в течение целого часа. Повторите эти действия для каждого из перечисленных буферов. Приготовьте 1,5 миллилитра двухмиллимолярной ГТФ в выбранном полимеризационном буфере.

Также приготовьте стандартное фосфатное разведение в диапазоне от нуля до 40 микромоляров в том же буфере. Далее готовят малахитовый зеленый рабочий реактив так, как описано в наборе для биопроб. Затем составьте четыре мастер-микса общим объемом 360 микролитров каждый, один мастер-микс содержит FDSZ, полученный из B subtilis, а мастер-микс два содержит FDS, полученный из кишечной палочки.

Мастер-смеси три и четыре используются в качестве контроля и содержат ЭДТА вместо хлорида магния. Далее пипетка 20 микролитров аликвот мастер-смеси и норм фосфатов. В A-Q-P-C-R 96-луночную пластину так, чтобы для каждой мастер-смеси было 16 лунок и норм фосфатов, расположенных так, как показано здесь.

Пипетка 180 мкл двухмиллимолярного запаса ГТФ до последней дорожки пластины. Затем поместите пластину в ПЦР-машину. Запустите программу с одним циклом, установленным на 30 градусов Цельсия, в течение 40 минут.

Во вторую 96-луночную пластинчатую пипетку по 20 микролитров аликвот малахитового зеленого рабочего реагента в лунки от А до Н 10. Затем на 60 микролитров полимеризационный буфер из эксперимента подается от A one до H eight, далее по 20 микролитров двухмиллимолярного раствора GTP в лунки в каждой полосе пластины. Один раз через заранее определенные промежутки времени, как показано здесь, чтобы изучить реакцию в различные моменты времени.

Проведите смеси вверх и вниз, чтобы перемешать их через 30 минут, начиная с первой дорожки на первой пластине, переведите 20 микролитров с первой дорожки первой пластины на первую дорожку второй пластины и пипеткой вверх и вниз для смешивания. Это начальная точка развития малахитового зеленого цвета для 30-минутной реакции, через 30 с половиной минут перелейте 20 микролитров со второй дорожки первой пластины во вторую дорожку второй пластины и перемешайте. Это отправная точка развития малахитового зеленого цвета для 20-минутной реакции.

Повторите эти шаги с оставшимися полосами с третьей по седьмую с 32-м интервалом через 33 с половиной минуты при 20 микролитрах GTP до восьмой дорожки на первой пластине и перемешайте. Затем переложите 20 микролитров в восьмую дорожку на второй тарелке и перемешайте. Это представляет собой реакцию нулевой минуты и является начальной точкой времени для развития цвета малахитового зеленого цвета.

Через 34 минуты добавьте 80 микролитров из девятой дорожки первой пластины, содержащей фосфатный стандарт, в девятую дорожку второй пластины и перемешайте через 34 с половиной минуты, перенесите 80 микролитров со второго стандарта фосфата в дорожке 10 первой пластины на девятую дорожку на второй пластине и перемешайте. Затем удалите из образцов все пузырьки воздуха и выдержите планшет при комнатной температуре еще 25 с половиной минут. Последующая инкубация.

Поместите планшет в 96-луночный считыватель планшетов, начиная через 60 минут с начала эксперимента. Измеряйте пластину с точностью 630 нанометров каждые 30 секунд в течение пяти минут, чтобы было взято 10 временных точек. Первое измерение пластины будет соответствовать первой полосе, второе — второй, и таким образом, чтобы у каждой полосы было точно одинаковое время для развития малахитового зеленого цвета.

Затем рассчитайте свободное содержание фосфатов в каждом образце с помощью стандартной калибровочной кривой фосфатов и отобразите данные в виде выделения фосфатов с течением времени. Затем рассчитайте активность гидролиза F-D-S-Z-G-T-P из линейного диапазона кривой. Здесь показано процентное содержание SEP F и FDSZ в гранулах образцов.

FDSZ был обнаружен в грануле выше фоновых уровней только тогда, когда в образце также присутствовали как SEP F, так и GTP. Точная стехиометрия SEPPE и FDSZ в этих канальцах неизвестна, но эти результаты свидетельствуют о том, что присутствует больше сеппа, чем FDSZ. Здесь показано светорассеяние FDSZ от B. subtilis и e. coli, собранных в присутствии двух миллимолярных ГТФ в 50-миллимолярном буфере хлорида калия.

F-D-S-E-B-S дает в 20–40 раз более высокий сигнал рассеяния света, чем FDSC EC, в зависимости от pH буфера. Интересно, что увеличение концентрации хлорида калия в буфере не оказывало существенного влияния на сигнал светорассеяния F-D-S-Z-E-C, но сигнал F-T-S-Z-B-S снижался примерно в 80 раз при pH 7,5, в 30 раз при pH 6,8 и в 45 раз при pH 6,5 в 300 миллимолярах хлорида калия по сравнению с буферами с 50 миллимолярами хлорида калия. Гидролизную активность ГТФ FDSZ измеряли в различных буферных условиях с использованием колориметрического анализа на свободный фосфат.

Установлено, что активность FT SZ в ГТФС увеличивается с увеличением концентрации хлорида калия при каждом из различных условий pH. При 50 миллимолярном хлориде калия активность ГТФА снижалась из-за связывания нитей F-D-S-Z-B-S на 50 миллимолярах. Хлорид калия FDSZ EEC обладал в три-шесть раз более высокой активностью ГТФС, чем F-D-S-Z-B-S, из-за более быстрой разборки полимеров FDSC EEC.

Наконец, разница в активности гидролиза ГТФ между F-D-S-Z-B-S и F-D-S-Z-E-C была уменьшена при 300 миллимолярах хлорида калия, возможно, из-за уменьшения связывания нитей F-D-S-Z-B-S. После этой процедуры могут быть выполнены другие металлы, такие как электромикроскопия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, связанные со структурой полимеров fts в образце.