Визуализация цитоплазматического кровотока во время заживления одноклеточной раны у Stentor coeruleus

Общая цель этой процедуры заключается в измерении потока цитоплазмы во время заживления раны в одной клетке. Это достигается путем сбора живых стентов или клеток SEIU для использования в качестве модельной системы для клеточного ранения. Вторым этапом является подготовка стеклянных инструментов к резке ячеек.

Затем клетки стента сариуса разрезаются на специальной установке микроскопа, которая позволяет одновременно проводить операцию с малым увеличением и визуализацию с высоким разрешением. Заключительным этапом является выполнение вычислительного анализа цитоплазматического потока с использованием программного обеспечения для моделирования скорости частиц. В конечном счете, визуализация цитоплазмы с высоким разрешением используется для отображения активной реакции клеток во время заживления раны.

Этот метод может быть использован для решения ключевых вопросов о заживлении клеточных ран, таких как становится ли цитоплазма гелеобразной вокруг области разреза, чтобы предотвратить утечку в окружающую среду. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку обработка ячеек, подготовка инструмента и этапы резки сложны для освоения, поскольку они требуют ловкости рук. Чтобы начать получать стент или клетки Сириуса либо из натурального понса, как описано в винном камне, либо от коммерческого поставщика, добавьте 300 миллилитров модифицированного стента или среды, адаптированной по рецептам винного камня, и отпугните, как описано в сопроводительном текстовом протоколе.

Поддерживайте культуры, выращивая их в темноте при температуре 20 градусов по Цельсию. Далее выращивают культуры хламидомонады рейнской выносливой водоросли в трис ацетатной фосфатной среде. Используя стандартные методы культивирования перед кормлением, промойте клетки хламидомонады, осторожно вращая их, удаляя надосадочную жидкость и суспендируя в модифицированном стенте или среде.

При необходимости кормите 300 миллилитровыми стентами или культурами сариуса около 30 миллионов клеток CHM два или три раза в неделю. Соберите стент или клетки для хирургического вмешательства. Для начала осторожно взбалтывайте культуру, пропуская воздух через наконечник пипетки, пока клетки не начнут отделяться и свободно плавать.

Затем захватите плавающие клетки с помощью пипетки объемом один миллилитр, оснащенной наконечником с широким отверстием, чтобы избежать сдвига клеток. После сбора дайте ячейкам осесть. Затем медленно отпижите средства над ними и добавьте свежий модифицированный стент или среду.

Подготовьте стеклянные иглы, используемые для резки клеток стента, держа два стеклянных стержня для перемешивания над изобилием и горелкой, пока концы не начнут плавиться. Затем соприкоснитесь концами двух стержней друг с другом, пока расплавленное стекло не вплавится. Как только они сплавятся, выньте их из пламени и дайте им остыть в течение одной-двух секунд.

Затем медленно раздвиньте их, чтобы сделать чистый разрыв. В идеале для этого получится игла длиной примерно один-два сантиметра с тонким концом на конце. Если полученная игла оказалась неоптимальной, разломайте наконечник в стеклянную талию и используйте стержни повторно.

Затем с помощью квадратной резиновой штамповки, покрытой вазелином, приготовьте квадратную камеру с вазелиновыми стенками, вдавливая ее в стеклянную крышку. Затем добавьте в квадрат вазелина 100 микролитров модифицированного стента или среды, содержащей 2% метилцеллюлозы. Поместите подготовленный покровный лист в пластиковый адаптер, а затем добавьте промытые ячейки стента к покровному листу.

Наконец, расположите ячейки в метилцеллюлозе так, чтобы они были равномерно расположены и прижаты достаточно близко к поверхности покровного стекла, чтобы быть в фокусе во время визуализации. Для начала поместите предметное стекло на предметный столик инвертированного микроскопа. Затем снимите корпус препарирующего микроскопа с подставки и определите примерное положение, в котором его нужно будет разместить, чтобы визуализировать предметное стекло при малом увеличении сверху.

Затем соберите двухъярусный микроскоп, добавив картонную коробку с нужным расстоянием между окуляром инвертированного микроскопа и препарирующим эндоскопом. Прикрепите коробку к месту с помощью лабораторной ленты, чтобы ее можно было легко снять Когда эксперимент будет завершен, убедитесь, что образец будет находиться в поле зрения и в фокусе без необходимости перемещать препарирующий эндоскоп После того, как он будет прикреплен, затем прижмите препарирующий эндоскоп к коробке и прикрепите его к коробке с помощью лабораторной ленты. Затем установите инвертированный микроскоп с помощью оптики DIC, установив на место 20-кратный воздушный объектив.

Кроме того, обязательно используйте конденсатор DIC с большим рабочим расстоянием, чтобы обеспечить достаточно места для выполнения микрохирургии сверху. Затем сфокусируйте клетки с помощью инвертированного микроскопа, все подготовив и сфокусировав с обеих сторон. Начните получать изображения с частотой кадров два изображения в секунду с помощью ПЗС-камеры 12 на пять.

Затем разрежьте ячейку с помощью стеклянной иглы. Зафиксируйте исходный характер цитоплазматического кровотока и наблюдайте за всеми стадиями заживления ран и их заживления. Прекращают сбор после того, как клетка восстановила нормальный вид или вновь начала активную подвижность.

Для начала скачайте PIV lab пакет MATLAB для измерения цитоплазматического потока с использованием скоростной симметрии изображения частиц. Затем загрузите стек изображений TIFF для каждого видеоряда в программу скорости симметрии изображения частиц в руководстве MATLAB. Вручную создайте маску для каждого стека изображений, чтобы скрыть области необработанных данных за пределами тела стента.

Затем установите PIV lab на использование быстрого преобразования Фурье и размера ячейки 64 на 64 пикселя, которая будет объединять пиксели в каждом кадре в большие квадратные пиксели. Затем запустите PIV lab для вычисления взаимных корреляций между пикселями в каждом кадре и соседними пикселями. В следующем кадре будет получен зависящий от времени вектор потока с центром в каждом пикселе изгиба, который имеет то же временное разрешение, что и исходные данные.

Затем вычислите средние временные значения результирующего векторного поля, чтобы сравнить данные, полученные с помощью стента до разреза и во время заживления раны. Кроме того, рассчитывайте гистограммы скоростей потока для изучения силы потока и изменения скорости в заданном пикселе с течением времени, чтобы изучить колебания потока. При визуализации последовательностей со стентом или клеткой, расщепленными пополам, рассчитайте общий поток цитоплазмы обратно в тело клетки, умножив среднюю скорость потока на площадь поперечного сечения основания пузыря внеклеточной цитоплазмы.

Здесь показано изображение стента или клетки в реальном времени, когда она разрезается и разрушается стеклянной иглой. После разреза значительное количество цитоплазмы вытягивается из основного тела клетки, но она быстро возвращается в клетку. После этой процедуры могут быть добавлены химические ингибиторы, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какие компоненты цитоскелета могут способствовать движению цитоплазмы во время стентирования или заживления ран.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как подготовить инструменты для разрезания стента к нашим клеткам и как визуализировать цитоплазматический поток во время разреза и заживления ран внутри одной гигантской клетки.