Установление минимальной бактерицидной концентрации противомикробного агента для планктонных клеток (MBC-P) и биопленочные клетки (MBC-B)

Эта процедура напрямую сравнивает планктонную и биопленочную устойчивость штамма бактерии, который может образовывать биопленку. Сначала создают биопленку, пополняют среду и применяют серийное разведение противомикробного средства по выбору. Затем дайте клеткам восстановиться в свежей, средней форме.

Теперь проведите анализ на жизнеспособность клеток с помощью гальванического покрытия на LB-шнеке. Окончательное определение минимальной бактерицидной концентрации планктонных и биопленочных клеток используется для демонстрации увеличения резистентности, которое происходит в результате роста биопленки. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что они загрязняют соседние колодцы или не дают зубцам многоконтактного устройства остыть настолько, чтобы они не убили бактерии.

Культуру, дикого типа и мутантный штамм бактерий в течение 16 часов в богатой среде при 37 градусах Цельсия, развести насыщенные за ночь культуры в свежую среду типа М 63, минимальную среду, с добавлением магния, сульфата и аргинина. Затем Eloqua. 100 микролитров на лунку.

Выделив по 24 лунки для каждого штамма, инкубировать в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия. Далее приготовьте 10 стоковых растворов разбавляющего ряда антибиотика на семь лунок и храните на льду. С помощью многоканальной пипетки удалите отработанную надосадочную жидкость, которая содержит планктонные клетки.

Затем добавьте 90 микролитров М 63 во все лунки и добавьте 10 микролитров соответствующего исходного раствора антибиотика для контроля без антибиотиков. Ну и на каждую репликацию и процеживание добавляем по 10 микролитров воды. Инкубируйте микротитровую пластину в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия.

С помощью многоканальной пипетки удалите отработанную надосадочную жидкость, которая содержит планктонные клетки. Добавьте во все лунки по 115 микролитров М 63 и продолжайте выращивать культуры в течение 24 часов. При 37 градусах по Цельсию.

Маркировка одного фунта шнековой пластины на одну половину 96. Хорошо микротитруем планшет для стерилизации многоконтактного устройства, погружаем его в 100% этанол и пропускаем зубцы через открытое пламя горелки Бунзена. Дайте зубцам немного остыть.

С помощью кончиков зубцов. Перенесите планктонную культуру из каждой лунки микротитровой пластины на поверхность шнековой пластины LB. Поместите пластины шнека LB при температуре 37 градусов Цельсия на 16 часов.

Затем визуально определяют порог для роста бактерий как минимальную бактерицидную концентрацию культуры антибиотика дикого типа и мутантного штамма бактерий в течение 16 часов в богатой среде при 37 градусах Цельсия, разбавляют насыщенные за ночь культуры от одного до 100 в свежую среду для анализов на устойчивость к антибиотикам в каждую лунку 96-луночной чашки микротитрования. Добавьте 90 микролитров бактериального разбавления. Теперь необходимо подвергнуть планктонные клетки воздействию градиента концентрации антибиотика.

Начните с 10 стоковых растворов антибиотика серии разведения, такого как тобрамицин мицин. Добавьте 10 микролитров стеблей антибиотика в соответствии с планом эксперимента. Затем добавьте 10 микролитров воды в контрольные лунки без антибиотиков для каждой репликации и штамма.

Инкубируйте микротитровую пластину в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия для анализа на наличие живых клеток. Начните с маркировки одной шнековой пластины LB для каждой половины 96-луночной пластины для микротитрования. Простерилизуйте многоконтактное устройство, обжигая его 100% этанолом.

Повторите один раз. Затем с помощью многоконтактного устройства перенесите около трех микролитров планктонной культуры из каждой лунки микротитровой пластины на поверхность шнековой пластины LB. Инкубируйте пластины при температуре 37 градусов Цельсия в течение 16 часов.

Затем определяют минимальную бактерицидную концентрацию антибиотика, определяя на глаз порог для роста бактерий. В этом эксперименте были использованы два различных анализа минимальной бактерицидной концентрации для сравнения чувствительности PA 14 дикого типа с мутантным штаммом, которому не хватает устойчивости к антибиотикам. Ген NDVB.

Здесь были измерены минимальные бактерицидные концентрации антибиотика тобрамицина для биопленки. MBCB для PA 14 составляет 100 микрограммов на миллилитр по сравнению с 12,5 микрограммами на миллилитр для мутанта. Напротив, минимальные бактерицидные концентрации тобрамицина для планктонных клеток составляли восемь микрограммов на миллилитр как для PA 14 дикого типа, так и для мутантов.

После освоения NBCB можно сделать примерно за час, разделив его на пять дней.