Методы модуляции и анализа NF-kB-зависимой нейрогенез

Общая цель этой процедуры заключается в исследовании функции транскрипционного фактора NF kappa B в мозге взрослого человека. Это достигается путем выведения трансгенных мышей, которые специфически ингибируют активность NF kappa B в нейронах. Вторым этапом процедуры является проверка поведенческих последствий ингибирования NF kappa B с использованием пространственной схемы, разделения или амбаров, лабиринта.

Третьим шагом является тщательное размножение животных, удаление мозгов и их правильное разделение. Заключительным этапом является анализ гистологических и структурных эффектов, таких как визуализация проекций мшистых волокон с помощью иммуноокрашивания. В конечном счете, использование поведенческого теста с последующей гистологией может коррелировать изменения в зависимом обучении зубчатой извилины со структурными изменениями в ассоциированных тканях.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как «Марсианская ваза», заключается в том, что пространственное разделение связей MA дает возможность целенаправленно измерять антизависимые от ребенка процессы обучения, а также нейродегенерацию и регенерацию в этой области мозга. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области взрослого нейрогенеза, такие как обучение как разделение специальных паттернов. Демонстрацией лабиринта будет заниматься Анжела Кула, техник из моей лаборатории.

Перфузия будет представлена Питером Хайманом, научным сотрудником. Затем разрез мозга будет показан техником Ульриха КА. И, наконец, конфокальную сканирующую микроскопию представит Джанин Муа, аспирантка моей лаборатории «Проведите разделение пространственных узоров».

Поведенческое тестирование в лабиринте Барнса в соответствии с международными и местными рекомендациями. Для этого анализа важно использовать только самцов мышей возрастом не менее полугода. Для каждой серии испытаний животные должны быть в возрасте до четырех дней, и один и тот же оператор должен проводить все тесты до тестирования.

Мышей следует кормить стандартным рационом, чтобы они были мотивированы сладкой пищей. Чтобы сначала настроить тест, приобретите белую пластину диаметром 120 сантиметров, изготовленную из твердого пластика. Дополнительные подсказки лабиринта могут быть изготовлены из разных материалов и иметь разную форму.

Важно, чтобы они обладали высокой контрастностью, чтобы их можно было четко распознать по бегущим колесам животного. Лестницы и туннели — все это хорошие подсказки. Расположите пластину под несколькими неоновыми люминесцентными лампами, которые работают умеренно интенсивно, чтобы у мышей была мотивация выйти на свет.

В помещении должна быть контролируемая влажность и постоянная температура 22 градуса по Цельсию. Теперь настройте систему видеослежения. Расположите камеру на расстоянии 115 сантиметров над центром пластины.

Затем прикрепите разноцветные дополнительные подсказки лабиринта к белой ткани, которая подходит к тарелке. Расположите их ближе к центру ткани так, чтобы они были хорошо видны животным. Теперь тщательно очистите пластину с помощью быстрого дезинфицирующего средства, которое может удалить любой запах из экспериментальной установки.

Расположите на белой тарелке семь одинаковых желтых домиков для еды. Их положения должны быть однозначно обозначены за сутки до начала тестов, приучить каждую мышь к диску. Поместите сладкие гранулы еды, такие как четвертинки фруктовой петли, внутрь каждого из семи домиков с едой для испытания жилья.

Положите каждую мышь на начальную точку тарелки и дайте ей 10 минут на исследование. Запишите это исследование между мышами. Очистите круглую тарелку и домики с едой быстрым дезинфицирующим средством.

Также пополняйте запасы еды в наградах. В течение следующих семи дней подряд запускайте тестовые испытания для тестов. Все дома, кроме одного, закрыты прозрачной лентой на весь эксперимент.

Это всегда один и тот же дом. Каждый дом по-прежнему загружен наградой, и испытание проводится как испытание привыкания. Проводите тесты в одно и то же время дня для каждого животного, чтобы избежать циркадных вариаций.

Позже проанализируйте задержку, пройденное расстояние и ошибки, используя соответствующую статистику. Программное обеспечение определяет ошибки как приближение к неправильному продуктовому магазину или установление контакта с подходящей коробкой, но неспособность войти и получить награду. Для сравнения групп используйте двустороннюю ANOVA с апостериорным тестом bon fer

Обезболив животное с помощью межбрюшинной инъекции вертина, осторожно пропертите его транссердечно PBS, содержащим гепарин и пропан. Сделайте отверстие в левом желудочке с помощью иглы 26 калибра. Также сделайте надрез в правом предсердии, чтобы дать отток крови и перфузу восьмерке.

Введите перфузионную иглу в левый желудочек в отверстие под прямым углом и на глубину от одного до двух миллиметров. Используйте гидростатическое давление от 1,2 до 1,4 метра и перфузируйте мышь в течение двух-четырех минут. Принимайте гепарин и пропан с 4% паральдегидом в PBS в течение 10-15 минут.

Перфузия должна составлять 15 миллилитров в минуту. Теперь препарируйте мозг. Она должна быть бледно-белой без видимых красных кровеносных сосудов.

Зафиксируйте все собранные мозги в 4% параформальдегиде при четырех градусах Цельсия на 24 часа. На следующий день. Криозащита мозга в 30% сахарозы в PBS, хранение их при температуре четыре градуса Цельсия в течение как минимум 24 часов спустя.

Мозги замораживаются на криотональной стадии и нарезаются на горизонтальные срезы толщиной 40 микрон. После окрашивания срезов антителом к нейрофиламенту М, проекции мшистых волокон могут быть визуализированы с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа на длине волны, соответствующей длине волны флуоресцентного антитела. Начните сканирование с малым увеличением и ориентируйтесь на гиппокамп и выступы мшистых волокон.

Затем при большем увеличении соберите сканы С-сечения с высоким разрешением мшистых волокон для анализа для изучения экспрессии трансгена I каппа B альфа AA one. У двух трансгенных мышей мозг был изолирован, криосекирован и окрашен с использованием антитела против конфокального лазерного сканирования GFP. Микроскопия выявила высокую экспрессию трансгена в области СА один, СА три и в ДГ для определения самого раннего типа клеток, экспрессирующих CAMK два альфа управляемых I каппа В альфа АА один в нейрогенной области гиппокампа.

Криосекции бегемота Campi от I Kappa BTTA. Животных окрашивали на двойной куртен, и конфокальный анализ трансгена выявил сигналы GFP в молодых DCX-положительных гранулярных клетках, отмеченных стрелками, указывающими на индукцию экспрессии трансгена за счет активности CAMK two alpha. Корональные срезы гиппокампа мышей i kappa BTTA и i Kappa B за вычетом нейрофиламента М были окрашены для визуализации проекций мшистых волокон и выявления сложной и везикулярной организации у мышей I kappa BTTA.

Выступы мшистых волокон были сильно нарушены. Кроме того, ингибирование NF kappa B привело к значительному уменьшению толщины лезвия и меньшему объему DG для изучения потенциальных причин резкого структурного дефекта. Свежие незафиксированные срезы гиппокампа от контрольной и I kappa BTTA мышей были окрашены фторнефритовым C, что позволяет специфически обнаруживать гибель нейрональных клеток.

Резко возросло количество вырождающихся нейритов у животных с двойным трансгеном по сравнению с контрольной группой. Кроме того, у мышей I kappa BTTA выявлено значительное увеличение трех положительных клеток расщепленного панциря. Напротив, иммуногистохимическое окрашивание против DCX выявило значительно увеличенное количество DCX-положительных клеток в мозге мышей I kappa BT.

Кроме того, d-CX-положительные клетки в I kappa B TTA hippo Campi были расположены не только в субгранулярной зоне, но и в более глубоких областях dg. В то время как положительные предшественники D CX у контрольных животных были локализованы почти исключительно в субгранулярной зоне. Проверка на повышенное количество клеток, экспрессирующих DCX, была результатом созревания более ранних предшественников или непосредственно следствием пролиферации DCX-положительных клеток.

BRDU вводили внутрибрюшинно мышам i kappa BTTA и контрольным мышам, которых затем криорезировали и окрашивали DCX и BRDU для анализа пролиферации. BRDU вводили однократно, а затем анализировали через 24 часа. Для анализа дифференцировки ежедневно выполняли три инъекции, а затем анализ через семь дней после одной инъекции BRDU.

Существенных различий в общем количестве BRDU-положительных клеток между I kappa BTTA-отрицательными и контрольными животными не наблюдалось. В отличие от этого, подход с тремя последовательными инъекциями выявил явно увеличенное количество B-R-D-U-D-C-X положительных клеток в DG I capa, BTTA. У мышей с нарушенной дифференцировкой или интеграцией клеток, экспрессирующих DCX, могло быть увеличено количество клеток, и клетки третьего типа могли быть вовлечены для специфического тестирования поведения двойных трансгенных мышей.

В задаче, зависимой от ДГ, использовался S-P-S-B-M. Контрольные животные I каппа B последовательно исследовали пищевые домики в первый день эксперимента. После семи дней тренировок животные смогли найти открытый домик с едой.

В отличие от них, животные IA BTTA продолжают серийно исследовать дома питания даже после обучения. Наблюдение значительного увеличения пройденных расстояний и более высоких латентных задержек и частот ошибок у животных I kappa BTTA по сравнению с контрольными животными i Kappa B позволяет предположить, что у этих животных были серьезные дефекты обучения. После того, как эта техника будет установлена, ее можно будет выполнять за 30 минут на животное, если она будет выполнена должным образом после ее освоения.

Этот метод может проложить дорогу другим нейробиологам, заинтересованным в задачах, зависящих от гироса у взрослых, таких как нейрогенез, дегенерация или регенерация у мышей.