Выращивание нервные стволовые клетки из обычных и нетрадиционных областях мозга взрослых грызунов

Общая цель данного эксперимента заключается в получении культур нейральных стволовых клеток из различных областей мозга взрослого грызуна. Это достигается путем забора ткани из интересующей области для изучения наличия и потенциала нейральных стволовых клеток. В качестве второго шага обработайте ткань в клеточную суспензию для нанесения покрытия в качестве монослойной культуры.

Затем используйте определенные условия культивирования для селективного размножения нейральных стволовых клеток, подтверждая их потенциал к самообновлению. Получены результаты in vitro, показывающие, что нейральные стволовые клетки являются мультимощными в зависимости от их дифференцировочного потенциала, а также от того, как различные факторы могут влиять на их самообновление и судьбу. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии и регенеративной медицины, например, где находятся эндогенные нейростволовые клетки и как ими манипулировать.

Впервые мы подумали об этой технике, когда обнаружили пути снижения сигналов. Это позволило нам не только идентифицировать предполагаемые эндогенные нейростволовые клетки, но и регулировать их количество. Поэтому мы применили эти знания для создания устойчивых культур этих клеток из разных областей мозга.

Изучите их свойства и задайтесь вопросом, действительно ли это стволовые клетки? Правильное приготовление блюд с культурой имеет решающее значение за два дня до запланированного вскрытия: покройте посуду поли-L орнитином в концентрации 75 микрограммов на миллилитр. Затем инкубируйте планшеты в течение ночи на следующий день, аспирируйте поли-L орнитин и дважды промойте каждую лунку тремя миллилитрами PBS в течение пяти минут за промывку.

Затем планшеты можно хранить в инкубаторе до трех недель После удаления последней промывки добавьте разбавленную клетчатку до 250 в PBS с помощью аккуратного пипетирования. Будьте осторожны, чтобы не перемешать раствор слишком сильно. Затем инкубируйте пластины в течение ночи в день вскрытия.

Аспирируйте фибронектин и дважды вымойте посуду с помощью PBS. Верните тарелки с окончательной промывкой PBS в инкубатор и дождитесь диссоциированной ткани. Неиспользованные пластины могут храниться в инкубаторе до недели, но не давайте им пересыхать и не взбалтывайте.

Демонстрация этого протокола масштабирована на трех взрослых крысах. Во-первых, обязательно охладите блок секции мозга на льду перед тем, как усыпить первую крысу. Затем подготовьте 15 миллилитровую коническую трубку на льду с пятью миллилитрами N, двумя средними и основными FGF.

После удаления мозга у усыпленной крысы поместите мозг в 10-сантиметровую чашку Петри, содержащую ледяной PBS. Затем перенесите мозг во вторую чашку PBS без остатков волос или крови. Теперь поместите мозг в охлажденный блок для секционирования и вставьте одно новое чистое лезвие бритвы в блок в непосредственной близости от интересующей области, из которой будут генерироваться клетки.

Далее вставьте второе чистое лезвие бритвы. Три миллиметра нянчимся с первым лезвием бритвы. Осторожно поднимите лопасти из блока, взяв за собой интересующий участок.

Снимите секцию с лопасти, погрузив ее в PBS. Теперь соберите интересующую область с помощью щипцов номер пять. В этом примере сечение содержит переднюю спайку. Уверенный.

Соберите срез в коническую пробирку объемом 15 миллилитров, содержащую пять миллилитров N двух сред с основным FGF. Затем уменьшите объем раствора до одного-двух миллилитров. Далее в колпак для клеточных культур погрузите одномиллилитровый наконечник пипетки на дно конуса и используйте около 20 потоков раствора для механической диссоциации ткани.

Остановите закатывание, когда раствор станет однородным, и дайте ему постоять несколько минут, чтобы более крупные несвязанные ткани осели на дно. Теперь перенесите однородную надосадочную жидкость без каких-либо кусочков ткани в коническую пробирку, содержащую 8,5 миллилитров дополненной и две среды. Перемешайте содержимое тюбика и получите готовую шестерку.

Колодец пластина. Удалите PBS из лунок, а затем добавьте три миллилитра клеточной смеси на лунку в три лунки в течение следующих 10-14 дней культивирования. Заменяйте среду свежей добавкой N два через день, начиная через 24 часа после нанесения через день, добавляйте свежий объем добавки через два раза.

Среда к среде уже на клетках. Внимательное отношение к условиям среды необходимо для того, чтобы клетки оставались недифференцированными и позволяли им размножаться. После первого изменения среды вместе с кровеносными сосудами оставалось большое количество клеточного мусора.

Тем не менее, в течение следующих нескольких дней стали заметны колонии различных пролиферирующих стволовых клеток. Также присутствовали более удлиненные веретенообразные клеточные популяции. Это не нейральные стволовые клетки, и в конечном итоге они были вытеснены по мере размножения нейральных стволовых клеток.

В течение следующих двух недель нейральные стволовые клетки росли более плотно, пока не достигли слияния. Эти культуры дали положительный результат на ряд маркеров стволовых клеток, включая SOX 2, hesi и nest. Таким образом, обеспечивается уверенность в том, что клеточные популяции, которые были отобраны и расширены, действительно являются нейральными стволовыми клетками.

Дальнейшее подтверждение пришло после извлечения FGF из среды, что позволило клеткам дифференцироваться в течение 10 дней в нейроны, астроциты и все циты цендры. Чтобы вызвать дифференциацию. Замените добавленную среду N two на унсу с добавленной N 2, средой и культивируйте клетки таким образом в течение 10 дней, заменяя N два каждые 48 часов через 10 дней. Аспирируйте среду и фиксируйте клетки двумя миллилитрами 4%-ного параформальдегида в лунке в течение 20 минут.

Смойте фиксатор тремя миллилитрами PBS дважды в течение пяти минут за одну стирку. После отсасывания второго промывки добавьте два миллилитра PBS, содержащего 5% обычной ослиной сыворотки и 0,1% триттона X 100 для проникновения и заблокируйте клетки, пока клетки инкубируются при комнатной температуре в течение 20 минут. Приготовьте первичную смесь антител в PBS, содержащую 5% NDS.

В этом примере антитело против T UJ one применяется для идентификации нейронов, в то время как антитела GFAP и CPA используются для визуализации астроцитов и олигодендроцитов соответственно. Через 20 минут аспирируйте блокирующий раствор и добавьте в каждую по 1,5 миллилитра первичной смеси антител. Хорошо инкубируйте клетки.

Добавьте комнатную температуру на 90 минут через 90 минут, промойте клетки двумя ваннами PBS, после чего после одного применения PBS, содержащего 5% NDS, используйте три миллилитра раствора и пятиминутные ванны. После удаления окончательного смывателя нанесите на каждое 1,5 миллилитра вторичных антител в PBS, содержащих 5% NDS. Ну а затем ставим тарелку в темноту, добавляем комнатную температуру и ждем 40 минут.

Через 40 минут замените вторичное двумя миллилитрами свежеприготовленного пятила DPI и подождите три минуты. После аспирации раствора DPI трижды промойте клетки тремя миллилитрами PBS в течение пяти минут за промывку. После этой процедуры клетки готовы к микроскопии.

Другие методы, такие как вестерн-блоттинг, могут быть выполнены для изучения изменений экспрессии белка и фосфорилирования, которые возникают в результате фармакологического лечения или в ходе дифференцировки клеток. После разработки этой техники она фактически проложила путь исследователям в области нейробиологии для тестирования новых методов, которые они применили в исследованиях на нескольких различных видах, включая мышей, крыс и даже приматов.