Двухфотонное Кальций изображений на мышах навигации среда виртуальной реальности
20 февраля 2014 г.
Здесь мы опишем экспериментальные процедуры, связанные с двухфотонного визуализации мыши коры во время поведения в виртуальной среде реальность.
Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы выполнить ключевые аспекты хронической двухфотонной визуализации на мышах, исследуя среду виртуальной реальности. Это достигается за счет модификации двухфотонного микроскопа для быстрой и стабильной визуализации у мышей. Затем устанавливается беговая дорожка с воздушной опорой, способная отслеживать локомоции.
Затем подготавливается среда виртуальной реальности, в которой используется синхронизированный с микроскопом светодиодный проектор с целью минимизации утечки света. В результате получаются хорошие и стабильные записи изображений за счет уменьшения артефактов движения, уменьшения утечки света и минимизации края фотоповреждения. Хотя этот метод можно использовать для измерения нейроактивности во время навигации в среде виртуальной реальности, он также может быть легко адаптирован к широкому спектру различных поведенческих парадигм, требующих визуальной стимуляции.
Все процедуры для животных были одобрены и проведены в соответствии с рекомендациями ветеринарного департамента кантона Basil sta. Двухфотонный микроскоп, используемый в этих экспериментах, состоит из сканирующей головки, состоящей из резонансного сканера с частотой восемь или 12 килогерц и стандартного гальванометра. Это обеспечивает частоту кадров 40 или 60 Гц при 750 умножить на 400 пикселей и снижает искажение изображения, вызванное движением мозга, фотообесцвечивание и фототоксичность.
Пьезоэлектрический высокоскоростной Z-шаговый процессор используется для последовательного получения изображений с чередованием по времени на нескольких глубинах. Механический бланкер используется для уменьшения лазерного воздействия на ткани в точках поворота траектории сканирования, бланкер должен быть отрегулирован для установки его ширины. В зависимости от амплитуды резонансного сканера подсоедините трубку подачи воздуха с внутренним диаметром не менее 10 миллиметров к держателю мяча беговой дорожки и поместите трубку BLE между основным подачей воздуха и держателем мяча для снижения шума.
Поместите шарик из пенополистирола диаметром 20 сантиметров в специально разработанный и напечатанный на 3D-принтере держатель для шариков. Если поведенческая парадигма требует только передвижения вперед и назад, вставьте булавку, например, иглу для подкожных инъекций 19-го калибра, на боковую сторону шара. Чтобы ограничить движение мяча по горизонтальной оси, используйте одну или две оптические компьютерные мыши для отслеживания движения мяча вокруг двух или всех трех осей соответственно.
Чтобы подготовить среду виртуальной реальности, используйте для дисплея светодиодные проекторы или компьютерные экраны со светодиодной подсветкой. Встроенная стробовая цепь для быстрого мерцания светодиодов во время визуализации. Частота мерцания в 24 килогерца на порядки превышает порог слияния мерцания, выше которого мерцание уже не воспринимается животным.
Чтобы синхронизировать световой поток проектора с точками поворота резонансного сканера для отслеживания зрачков, отрегулируйте точную частоту мерцания и рабочий цикл, используйте видеокамеру на базе CMO. Убедитесь, что камера не содержит инфракрасного блокирующего фильтра. Примерно через две-три недели после инъекции генетического индикатора кальция и имплантации черепного окна используйте эпифлуоресцентное освещение для проверки четкости и экспрессии имплантата черепного окна.
Хорошо заметны и четко очерчены. Границы поверхностных кровеносных сосудов являются хорошим показателем того, что оконный имплантат подходит для визуализации через один-два дня. Чтобы провести двухфотонный эксперимент, измерьте и отрегулируйте мощность лазера до значения ниже 50 милливатт на образце.
Затем включите подачу воздуха на сферическую беговую дорожку. Далее головой зафиксируйте животное на шаровой беговой дорожке. Первые несколько раз мышь фиксируется головой.
Этот процесс можно облегчить, кратковременно успокоив животное изофтором. Как только животное привыкнет к процедуре, монтаж обычно может быть выполнен без седации. Обратите внимание, что очень важно свести к минимуму стресс для животного во время этой процедуры.
Затем расположите систему визуального отображения как можно ближе к животному, чтобы обеспечить доступ к животному. Убедитесь, что на имплантате краниального окна нет грязи, и при необходимости промойте его водой, нанесите прозрачный ультразвуковой гель в качестве среды для погружения между краниальным окном и объектом для погружения в воду для экранирования света. Оберните кусок черной ленты вокруг объектива и передней планки.
Переместите арену виртуальной среды в конечное положение и настройте видеокамеру для отслеживания зрачков. Наконец, настройте лазерный гаситель в соответствии с амплитудой сканирования, используемой во время эксперимента, и начните запись данных после завершения экспериментов. Усыпьте животное в соответствии с рекомендациями вашего учреждения.
Качество изображения при двухфотонной кальциевой визуализации клеточных популяций, меченных генетическим индикатором кальция, в значительной степени зависит от качества имплантата краниального окна, как показано здесь при проверке краниального окна на прозрачность после введения вируса, не должно быть видно грануляционной ткани или повторного роста кости. При этом рисунок поверхностных кровеносных сосудов должен оставаться неизменным, а границы сосудистой сети должны быть четко очерчены. В то же время BOI меченых клеток должен быть хорошо виден под эпифлуоресцентным микроскопом.
В идеале препарат должен быть достаточно стабильным, чтобы искажения двух фотонных изображений, вызванные локомоцией мыши, не были видны на изображении после регистрации кадра. Утечка света от системы визуальной стимуляции может быть полностью устранена путем правильного синхронизации светового потока проектора с точками оборота резонансного сканера. Если данные не получены, частота мерцания источника света должна быть в два раза больше частоты сканирования.
В этом примере бланкер был удален, чтобы проиллюстрировать эффект утечки света, показанный в оранжевых прямоугольниках во время визуальной стимуляции. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как выполнять двойные действия в визуализации, поведении мышей, навигации в среде виртуальной реальности. В дополнение к настройке систем визуализации и виртуальной реальности, как описано здесь, ключом к успеху в этих экспериментах является освоение техники имплантации черепных окон.
Чистый имплантат является необходимым условием для получения высококачественных изображений и стабильной записи.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описаны экспериментальные процедуры хронической двухфотонной визуализации коры головного мозга мыши во время перемещения субъектов в среде виртуальной реальности. Методология направлена на минимизацию артефактов и повышение качества изображений в ходе поведенческих исследований.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Методы визуализации
- Поведенческие исследования
Теоретическое обоснование
- Хроническая двухфотонная визуализация позволяет наблюдать нейронную активность у живых субъектов.
- Среды виртуальной реальности могут обеспечивать контролируемые стимулы для поведенческих экспериментов.
- Минимизация утечки света и двигательных артефактов имеет решающее значение для получения высококачественных изображений.
- Адаптивные методы могут быть применены к различным поведенческим парадигмам.
Цель исследования
- Изучение нейронной активности мышей при навигации в условиях виртуальной реальности.
- Разработка стабильной системы визуализации, позволяющей осуществлять перемещение.
- Углубление понимания функций мозга в ответ на визуальные стимулы.
Используемые методы
- Модификация двухфотонного микроскопа для высокоскоростной визуализации.
- Установка беговой дорожки с воздушной поддержкой для отслеживания локомоции.
- Подготовка синхронизированной среды виртуальной реальности с использованием LED-проектора.
- Внедрение методов по снижению артефактов движения и утечки света.
Основные результаты
- Были достигнуты стабильные и высококачественные записи изображений.
- Снижение артефактов движения повысило достоверность измерений нейронной активности.
- Метод универсален и может быть адаптирован для различных поведенческих исследований.
- Успешная демонстрация измерения нейронной активности во время навигационных задач.
Выводы
- Модифицированная установка для визуализации эффективна для изучения активности мозга у мышей в процессе поведенческих реакций.
- Среды виртуальной реальности позволяют получить ценные данные о нейронных реакциях на стимулы.
- Данный подход может быть использован в широком спектре экспериментальных парадигм.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный метод позволяет осуществлять длительный высокоточный мониторинг нейронной активности у мышей в условиях свободного поведения, что способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков при поиске нейропсихиатрических лекарственных средств. За счет стабилизации двухфотонной визуализации во время локомоции этот подход повышает достоверность прогнозов в исследованиях модуляции сигнальных путей. Данный метод связывает результаты, полученные in vitro, с функциональными показателями in vivo, обеспечивая трансляционную преемственность при разработке терапевтических средств, направленных на ЦНС.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы посредством анализа динамики кальция в конкретных типах клеток во время целенаправленной навигации.
- Практическая ценность: Снижает механистическую неопределенность, связывая активность популяций нейронов с определенными поведенческими результатами в контролируемой парадигме виртуальной реальности (VR).
- Прогностическая ценность: Способствует приоритизации портфеля препаратов, предоставляя количественные и воспроизводимые нейрофизиологические показатели взаимодействия с мишенью.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга соединений путем создания стабильных окон визуализации с минимальным количеством артефактов.
- Количественные данные: Обеспечение возможности измерения зависимых переменных на основе флуоресценции (ΔF/F) для проведения анализа зависимости «доза-ответ» и кинетического анализа.
- Масштабируемость: Возможность повторного использования платформы в различных поведенческих парадигмах благодаря синхронизированной LED-проекции и инфраструктуре отслеживания движений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: способствует изучению дисфункции нейронных цепей в моделях, соответствующих нейропсихиатрическим и нейродегенеративным показаниям.
- Трансляционная преемственность: связывает механизмы раннего поиска с доклинической валидацией посредством последовательной лонгитюдной регистрации нейронной активности.
- Продвижение с учетом рисков: обосновывает решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), выявляя, вызывает ли модуляция мишени ожидаемые эффекты на уровне цепей во время поведенческих реакций.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в процесс поиска лекарственных средств — от проверки гипотез до оптимизации соединений-лидеров, обеспечивая получение механистических данных, которые позволяют обосновать выбор мишени и расставить приоритеты при отборе соединений.
- Биология открытий: способствует уточнению сигнальных путей и валидации мишеней, обеспечивая картирование клеточной активности в процессе выполнения навигационных задач.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа и воспроизводимые количественные результаты, необходимые для надежной оценки соединений в программах по изучению ЦНС.
- Аналитика: предоставляет измерения ΔF/F и корреляции поведения с привязкой ко времени, что позволяет проводить статистическое сравнение экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность от этапа открытий к доклиническим работам за счет стабильной хронической визуализации генетически определенных популяций нейронов.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу визуализации, адаптируемую к различным парадигмам зрительной стимуляции в рамках множества проектов.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозирования модуляции мишени за счет снижения шума, вызванного двигательными артефактами и утечкой света.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и стандартизацию благодаря синхронизированному блокированию лазера и трекингу зрачка.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала за счет снижения частоты неудач в программах по ЦНС на поздних стадиях путем раннего снижения механистических рисков.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритезацию соединений с учетом рисков на основе функциональных эффектов в нейронных цепях, а не только на основе аффинности связывания.
Особенности реализации
- Требуются навыки проведения операций по созданию краниального окна, экспрессии генетических индикаторов кальция и юстировки системы двухфотонной микроскопии.
- Работа зависит от наличия высокоскоростного резонансного сканирования, пьезоэлектрического Z-степпинга и систем LED-проекции со схемами синхронизации.
- Необходима межкомандная стандартизация этапов хирургической подготовки, поведенческого обучения и конвейеров обработки изображений.
- Необходимо учитывать особенности конкретных моделей в отношении фиксации головы, механики беговой дорожки и охвата поля зрения.
- Практические ограничения включают окно хирургической жизнеспособности, стабильность экспрессии индикатора и чувствительность к остаточным артефактам движения, несмотря на их коррекцию.
