Наблюдение и количественная оценка Фибробластовой Фибрин Гель Компактион

Общая цель данной процедуры заключается в наблюдении и анализе влияния взаимодействий между клетками и матриксом на переориентацию волокон и процессы ремоделирования матрикса в системе фибринового геля. Для этого сначала проводят полимеризацию трехмерного фибринового геля, содержащего микросферы, на покровном стекле внутри биореактора с контролируемыми условиями окружающей среды. На втором этапе готовится концентрированная клеточная суспензия, которая используется для размещения кластеров фибробластов или эксплантатов X в виде геометрических структур на поверхности геля.

Затем в течение 48 часов каждые 15 минут проводится визуализация образца с помощью дифференциально-интерференционного контрастного микроскопа. Заключительным этапом является измерение степени реорганизации и ремоделирования фибрина в виде деформации в различных областях геля с использованием метода цифровой корреляции изображений. В конечном итоге данная система экспланта позволяет располагать клетки в виде простых геометрических фигур, что упрощает визуализацию и изучение механизмов, лежащих в основе клеточного ремоделирования матрикса и переориентации волокон.

Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области механической биологии, такие как влияние пространственных и временных механических стимулов на поведение клеток и вызванные этим изменения в матриксе окружающих тканей. Эту процедуру продемонстрирует Arabic de Jesus, аспирант моей лаборатории. Осторожно растворите фибриноген в предварительно нагретом до 37 °C физиологическом растворе в течение ночи для приготовления стокового раствора с концентрацией 33,3 mg/mL. Подготовьте трафарет на перфиле, чтобы разметить расположение каждого экспланта x в соответствии с заданной геометрией пространства.

Каждая точка должна находиться на расстоянии примерно от одного до двух миллиметров друг от друга. Такое расстояние соответствует оптимальному интервалу для формирования выравнивания волокон между эксплантами. Затем тщательно очистите все компоненты биореактора 70% этанолом и поместите очищенные детали под УФ-излучение в шкафу для культивирования тканей на два-три часа перед началом процесса.

После стерилизации компонентов биореактора с помощью ленты закрепите трафарет под областью покровного стекла диаметром 60 миллиметров, где будет подготавливаться образец. Затем приготовьте суспензию микросфер, после чего — фибриноген и тромбин. Для приготовления рабочих растворов смешайте в микроцентрифужной пробирке 0,017 миллилитров стокового раствора микросфер и 0,149 миллилитров DMEM, чтобы достичь концентрации 10 миллионов микросфер на миллилитр.

Затем подвергните суспензию воздействию ультразвука в течение 10 минут для диспергирования микросфер и гомогенизации раствора. В центрифужную пробирку объемом 15 мл добавьте 0,22 мл стокового раствора фибриногена, 0,44 мл 20 мМ HEPES-буфера и 0,1667 мл раствора микросфер. Осторожно перемешайте компоненты, после чего поместите пробирку на лед в отдельную центрифужную пробирку объемом 15 мл.

Смешайте вместе 32,8 µL тромбина, растворенного в физиологическом растворе в концентрации 25 units/mL, 131 µL 20 mM HEPES-буфера и 2,46 µL 2 M хлорида кальция.

Затем осторожно перемешайте подготовленные растворы тромбина и фибриногена, 5–10 раз пропипетировав смесь до достижения однородности. Старайтесь минимизировать появление пузырьков в смеси, не вытесняя раствор из пипетки полностью во время перемешивания. Как можно быстрее перенесите перемешанный раствор в формы из PDMS размером 8 мм² на покровном стекле и оставьте гель для полимеризации при комнатной температуре.

Добавление тромбина приведет к быстрому гелеобразованию раствора примерно через 30 секунд после полимеризации; закройте биореактор и подготовьте эксплантаты клеток. Для этого соберите клетки дермальных фибробластов человека из флакона T 75 при достижении 70–90% конфлюэнтности, используя трипсин, и осадите их центрифугированием при 200 ×g в течение пяти минут. Перенесите биореактор в бокс биологической безопасности и осторожно снимите крышку, соблюдая условия асептики. Затем аспирируйте среду и ресуспендируйте клеточный осадок в DMEM с 10% FBS до конечной концентрации 20 миллионов клеток на миллилитр.

Затем создайте эксплантаты, набрав клетки в микропипетку и внеся 0.3 µL клеточной суспензии в полимеризованный фибриновый гель. Согласно шаблону, каждый эксплантат должен содержать примерно 6 000 клеток. После размещения эксплантатов в геле герметично закройте биореактор.

Затем установите нагревательные блоки и подключите термопары к контроллеру температуры. Установите на контроллере температуру 37 °C и инкубируйте гели в течение одного часа, чтобы клетки осели и прикрепились к фибриновому матриксу. Затем добавьте примерно 5 mL DMEM, который предварительно кондиционировали в течение двух-трех часов с 5% CO2 и дополнили 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% пенициллина-стрептомицина, 0,1% амфотерицина B и 10 µg/mL апротинина, непосредственно в камеру биореактора.

Затем снова герметично закройте биореактор. С помощью шприца введите дополнительные 5 mL среды, кондиционированной углекислым газом, через штуцер на впускном порту, чтобы полностью заполнить биореактор, стараясь удалить все образующиеся пузырьки воздуха. Подготовьте шприцевой насос со шприцем объемом 10 mL или 30 mL, заполненным дополнительной средой, кондиционированной 5% CO2. Подсоедините шприц непосредственно к впускному порту на крышке биореактора с помощью стерильной трубки с разъемом Luer Lock.

Установите скорость перфузии на шприцевом насосе на 0.01 milliliters per minute. Затем подсоедините модифицированные отрезки трубок к обоим выпускным портам и поместите их концы в стакан объемом 100 milliliter. Для сбора отходов используйте лабораторный подъемник, чтобы отрегулировать высоту входного и выходного потоков таким образом, чтобы в системе подачи биореактора не создавалось перепада давления.

В течение всего эксперимента в биореактор подавали свежую среду, кондиционированную 5% carbon dioxide. Для поддержания pH, обеспечения питательными веществами и удаления продуктов обмена веществ шприца объемом 10 milliliter, заполненного средой, будет достаточно примерно на 16 hours. Установите объектив 20 XDIC под смотровое окно микроскопа и убедитесь, что поляризатор, анализатор и призма установлены правильно.

Затем откройте программное обеспечение для визуализации. Сфокусируйте объектив на области между тремя x explan и сохраните координаты X, Y и Z этого местоположения в программе. Чтобы получить изображение всей области между x explan и вокруг них, выберите опцию получения изображения большой области и укажите размер этой области.

Это позволит получить несколько изображений вокруг заданной области и создать большое мозаичное изображение; установите интенсивность света и время экспозиции на минимально возможные значения. Это поможет избежать гибели клеток, вызванной фототоксичностью, при сохранении разрешения, достаточного для различения клеток, микросфер и волокон фибрина. Обратите внимание, что в данном конкретном эксперименте волокна фибрина не видны из-за высокой плотности светорассеивающих сфер в геле; для визуализации волокон фибрина уменьшите плотность сфер или толщину геля.

Затем приступите к отслеживанию деформации. Сначала создайте или загрузите соответствующий код MATLAB, после чего выполните совмещение изображений, используя микросферы, распределенные по всему гелю, в качестве референтных точек. Совмещение обеспечит получение снимков точно в одном и том же месте при каждом повторении.

Перераспределение волокон в экспланте наблюдали путем получения мозаичных изображений каждые 15 минут. В течение 48 часов из мозаичных изображений извлекали отдельные области и анализировали их с помощью алгоритма отслеживания деформации. Для измерения локальных деформаций по смещению микросфер на контурных графиках показано распределение максимальной главной деформации в области перераспределения волокон, соответствующей ремешку.

После освоения эта методика может быть выполнена примерно за три-четыре часа при условии соблюдения всех правил. После проведения данной процедуры могут быть применены другие методы, такие как флуоресцентное мечение коллагена и белков цитоскелета, а также количественный анализ миграции клеток, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, о том, какие механобиологические пути участвуют в ремоделировании тканей и как эти процессы модулируются различными биохимическими веществами.