Анализ скелетных мышц дефектов в личинок данио рерио по двулучепреломления и сенсорный вызывают Побег реагирования Анализы

Общая цель данной процедуры заключается в оценке степени организации миофибрилл у прозрачных личинок zebrafish, а также в количественном определении пройденного ими расстояния при плавании в ответ на тактильную стимуляцию для обоих методов. Это достигается сначала путем скрещивания zebrafish, а затем путем сбора жизнеспособных икринок на втором этапе анализа по оценке структуры мышц. Покрытый анестезированный эмбрион zebrafish помещают непосредственно между двумя поляризационными линзами на предметном столике стереомикроскопа так, чтобы рыба была ориентирована вдоль латеральной оси своего тела и находилась в максимально плоском положении.

Затем визуализируют двулучепреломление и количественно оценивают целостность мышц. На втором этапе теста на реакцию избегания, вызываемую прикосновением, одну обработанную личинку помещают в глубокую чашку Петри, после чего центрируют в поле зрения стереомикроскопа. Личинке подают сенсорный стимул, касаясь хвоста энтомологической булавкой, и регистрируют реакцию животного до тех пор, пока эмбрион не прекратит плавать или не выплывет из поля зрения.

В конечном итоге можно количественно оценить различия в организации мышц и локомоторных реакциях. Основными преимуществами этих неинвазивных методов являются возможность быстрого анализа большого количества рыб и возможность мониторинга дефектов скелетных мышц у одной и той же особи in vivo в течение нескольких дней. Наглядная демонстрация установки поляризационных линз и размещения личинок в правильном положении имеет решающее значение для обеспечения успеха.

С помощью этих методов удалите нежизнеспособные икринки из всех кладок, собранных после спаривания взрослых рыб. Обычно такие икринки выглядят белыми и непрозрачными при визуальном осмотре или как скопление темных дезорганизованных клеток под микроскопом; верните эмбрионы в инкубатор для дальнейшего развития на третий–седьмой день после оплодотворения. Если интересующий эмбрион остается внутри хориона, с помощью острых пинцетов аккуратно сделайте разрез в хорионе этого эмбриона, затем переверните икринку, чтобы эмбрион выпал.

Анестезируйте покрытые эмбрионы с помощью трикаина, чтобы облегчить их правильное позиционирование, затем оснастите диссекционный микроскоп поляризационной линзой, которую можно вращать для регулировки угла поляризации света. Когда эмбрионы выпрямятся, установите вторую поляризационную линзу на предметном столике микроскопа непосредственно под верхней линзой и поместите эмбрионы прямо на вторую линзу. Каждый исследуемый эмбрион должен быть расположен вдоль латеральной оси своего тела.

Поворачивайте верхнюю линзу, удерживая в поле зрения интересующий эмбрион, до тех пор, пока оси поляризации двух линз не окажутся ориентированы под углом 90 градусов друг к другу, а фон не станет полностью темным. Переместите рыб, чтобы убедиться, что они лежат максимально плоско. Если тело рыбы изогнуто, поляризованный свет пройдет только через сегменты с плоской ориентацией, и в них будет наблюдаться двулучепреломление.

Теперь изучите фенотип двулучепреломления (birefringence) рыб дикого типа. Высокоорганизованные скелетные мышцы демонстрируют яркое двулучепреломление, так как показатель преломления света, параллельного миофиламентам, выше, чем для поляризованного света, перпендикулярного этим структурам. У рыб с дезорганизацией скелетных мышц, что указывает на нейродегенеративную миопатию или порок развития, обычно наблюдается общее снижение двулучепреломления.

Характерный признак мышечной дистрофии. Обычно наблюдается пятнистый характер двулучепреломления, при котором темные области представляют собой дегенерацию мышц на фоне светлых областей с нормальной структурой мышечной ткани. Снимите изображения рыб в поляризованном свете для количественной оценки двулучепреломления.

Сохраните изображения в формате tiff. Откройте изображения двулучепреломления в программе для обработки изображений. Если вы используете Image J, как показано здесь, то для каждого изображения сначала с помощью инструмента многоугольного выделения (polygon selections tool) обведите тело рыбки, чтобы определить область мышц zebrafish для измерения.

Затем в выпадающем меню analyze выберите set measurements, чтобы определить необходимые статистические параметры для изображения. Отметьте флажками area mean gray value, а также min and max gray value для настройки анализа поведения избегания, вызванного прикосновением, через два-семь дней после оплодотворения. Поместите окрашенных рыб, представляющих интерес, по отдельности в глубокие чашки Петри, работая только с одним эмбрионом за раз.

Расположите рыбку в центре поля зрения стереомикроскопа, оснащенного системой цифровой камеры, и начните последоваемую съемку с частотой кадров не менее 30 Гц. Затем с помощью энтомологической булавки коснитесь хвоста эмбриона, чтобы создать сенсорный стимул, прекратив съемку, когда эмбрион перестанет плавать или выплывет из поля зрения. Наконец, преобразуйте последовательность изображений в видеофайл или проанализируйте отдельные кадры таймлапс-съемки.

Метод анализа двулучепреломления вне живого организма (offline birefringence) может быть использован в качестве эффективного неинвазивного анализа для изучения состояния организации миофибрилл в живых эмбрионах данио-рерио; эмбрионы дикого типа данио-рерио на пятый день после оплодотворения демонстрируют выраженное двулучепреломление скелетных мышц при полярном свете благодаря упорядоченному расположению миофиламентов. Напротив, эмбрионы того же возраста, гомозиготные по патогенной мутации в гене дистрогликана или DAG1, демонстрируют очаговое двулучепреломление, указывающее на области дегенерации мышц. Такой пятнистый характер и быстрое прогрессирование мышечной дегенерации на ранних этапах развития согласуются с данными по другим моделям дистрофии у рыб.

Количественный анализ двулучепреломления у мутантов DAG one с дистрофией на пятый день после оплодотворения выявил значительное снижение яркости до 27,9 ± 5,3% от максимального двулучепреломления, наблюдаемого у их сибсов дикого типа. Это снижение более выражено, чем снижение до 52,4 ± 5,5%, которое наблюдалось у морфрантов mtm one с миопатией на третий день после оплодотворения. Модели рыб с миопатией, напротив, имеют тенденцию к общему снижению двулучепреломления по сравнению с диким типом, так как в основных осевых скелетных мышцах часто наблюдается дезорганизация миофибрилл, но нет признаков дегенеративных изменений. Поведение при попытке избежать прикосновения может быть использовано для демонстрации того, что модели заболеваний скелетных мышц у zebrafish проявляют двигательные дефекты и трудности при плавании.

В первом видео показан тест на вызванное прикосновением поведение избегания у зебраниновых рыбок дикого типа. Обратите внимание, что на пятый день после оплодотворения нормальные личинки уплывают очень быстро. Во втором видео зафиксировано поведение избегания, вызванное прикосновением, у личинок одного дня.

Обратите внимание, что на пятый день после оплодотворения эмбрионы мутантов демонстрируют нарушенную реакцию на прикосновение и не покидают поле зрения после стимуляции. Затем видеозаписи были проанализированы покадрово, что подтвердило снижение подвижности мутантов DAG one по сравнению с контрольной группой дикого типа в ответ на тактильные стимулы. Средние значения расстояний, которые эмбрионы обоих типов смогли преодолеть за фиксированный интервал времени, указывают на снижение двигательной функции у мутантов DAG one.

После освоения эти методы могут быть применены к большому количеству рыб за короткий промежуток времени, что крайне важно при проведении высокопроизводительного химического скрининга или скрининга на мутагенез. После выполнения данной процедуры можно использовать более инвазивные подходы, такие как иммуногистохимия или электронная микроскопия, для исследования дефектов скелетных мышц на молекулярном и структурном уровнях.