Растянуть в мозге эндотелиальные клетки микрососудов (CEND) в качестве In Vitro Травматические повреждения мозга Модель из гематоэнцефалического барьера

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать использование растяжимой травмы в качестве модели черепно-мозговой травмы. Это достигается путем предварительного культивирования, зеркального отражения микрососудистых эндотелиальных клеток и гибких донных лунок. Вторым этапом является дифференцировка клеток путем уменьшения сыворотки крови теленка плода в питательной среде.

Далее клетки травмируются с помощью устройства для растяжения клеток. Завершающим этапом является оценка степени травмации в клетках. В конечном счете, индуцированное растяжением повреждение эндотелиальных клеток мозга используется для демонстрации повреждения гематоэнцефалического барьера in vitro.

Применение этого метода распространяется на терапию черепно-мозговой травмы, поскольку он моделирует фактическое воздействие, которое происходит во время ЧМТ на гематоэнцефалический барьер с использованием растяжения эндотелиальных клеток морского мозга. Демонстрировать процедуру будет доктор Элейн Сальвадор, постдок из моей лаборатории. Начните эту процедуру с культивирования микрососудистых эндотелиальных клеток морского мозга в колбе с культурой T 75.

Меняйте среду два раза в неделю до тех пор, пока не будет достигнуто слияние. Далее промойте клетки с помощью PBS. Затем удалите PBS и трипсы.

Анизируйте клетки двумя миллилитрами теплого раствора триина ЭДТА. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут или до тех пор, пока клеточный слой не рассеется. После этого при введении восьми миллилитров питательной среды в клетки несколько раз постучите по колбе, чтобы отсоединить клетки.

Просмотрите клетки под микроскопом, чтобы убедиться в полном отрыве от колбы. Затем пипетируйте среду с отделенными ячейками вверх и вниз. После этого перемешайте колбу, чтобы перемешать клеточную суспензию.

Добавьте 20 микролитров клеточной суспензии в гемоцитометр, и подсчитайте количество клеток. Определите плотность ячеек и загляните в лунку с точностью 20 000 клеток на квадратный сантиметр. Далее переведите клеточную суспензию в коллаген.

Один из них предварительно закодировал шесть. Хорошо гибкие донышки культивируют планшетами в общем объеме три миллилитра на лунку. Меняйте питательную среду два раза в неделю и выращивайте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение одной недели до слияния.

Для дифференцировки клеток замените питательную среду клеток средой для дифференцировки и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов. При этой процедуре включите устройство контроллера повреждения клеток, установите задержку на 50 миллисекунд. Далее установите давление регулятора на 15 PSI и пару раз нажмите на спусковой крючок, пока зарегистрированное пиковое давление не станет стабильным.

Затем установите давление регулятора на нужное значение. После этого поместите шесть хорошо гибких донышек культуральной пластины в держатель лотка. Убедитесь, что селектор лунок настроен на правильный размер лунки.

Затем плотно поместите вилку адаптера на место, хорошо удерживайте вилку на месте одной рукой, а другой рукой нажимая на спусковой крючок, записывая пиковое давление, созданное впоследствии. Немедленно поместите планшет обратно в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на желаемый период времени или немедленно используйте для последующих экспериментов или оценки для оценки повреждения от растяжения с помощью анализа поглощения DI. Сразу после этого клетки растягивают на 30 микролитров одного миллиграмм на миллилитр красителя, который выступает маркером цитотоксичности к среде для культивирования клеток.

Оценить растяжимую травму по высвобождению лактатдегидрогеназы. После растяжения клетки немедленно удаляют 200 микролитров среды для клеточных культур, что делает то же самое для каждого момента после травмы, который вы хотели бы включить в свое исследование высвобождения ЛДГ. Затем центрифугируйте среду для культивирования клеток при максимальной настройке микроцентрифуги в течение пяти минут.

Чтобы удалить остатки клеток, удалите надосадочную жидкость и используйте ее для последующих шагов. После того, как были взяты необходимые образцы из разных временных точек, клетки облизываются с помощью раствора для лизиса, входящего в набор для анализа LDH. После этого добавьте 100 микролитров пробирной среды, входящей в набор для анализа, в каждую лунку планшета на 96 лунок, входящего в комплект.

Затем добавьте 100 микролитров бесклеточной питательной среды в две параллельные лунки из 96. Хорошо инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут и считывайте поглощение при 492 нанометрах. Здесь представлено световое микроскопическое исследование нормальных клеток на фоне поврежденных.

Нормальный нерастянутый монослой клеток слияния плотно упакован и удлинен Когда клетки растягиваются импульсом пикового давления от 1,8 до 2,0 фунтов на квадратный дюйм, они кажутся менее компактными. При умеренном повреждении клеток импульсом пикового давления от 2,5 до 3,0 некоторые из них выглядят опухшими и деформированными. Клетки втягиваются с сильным растяжением от 3,5 до 4,5 фунтов на квадратный дюйм.

Вот флуоресцентное микроскопическое исследование нормы на фоне поврежденных клеток. Клетки были обработаны с помощью окрашивания на жизнеспособность через два часа после травмы. Это контрольные нерастянутые клетки, умеренно растянутые клетки и сильно растянутые клетки.

На этом рисунке показано высвобождение фермента ЛДГ в организм после травмы растяжения ЛДГ, высвобожденного в культуру. Среда измерялась через различные промежутки времени после травмы, вызванной растяжением, и выражалась в процентах от общего высвобождаемого L-D-H-L-D-H, высвобождаемого из клеток, которые подвергались низкому и умеренному растяжению. Существенно не отличались от таковых у нерастянутых органов управления и друг от друга.

Клетки, которые были сильно растянуты, высвобождали значительно большее количество ЛДГ по сравнению со всеми другими образцами, за исключением умеренно растянутого образца через час после его развития. Этот метод проложил путь исследователям в области нейробиологии к изучению черепно-мозговых травм в эндотелиальных клетках морского мозга in vitro.