Растянуть в мозге эндотелиальные клетки микрососудов (CEND) в качестве

Общая цель данной процедуры — продемонстрировать использование растяжения в качестве модели черепно-мозговой травмы. Это достигается путем первоначального культивирования микрососудистых эндотелиальных клеток в лунках с гибким дном. Вторым этапом является дифференцировка клеток путем снижения концентрации сыворотки теленка в культуральной среде.

Затем клетки подвергают повреждению с помощью устройства для растяжения клеток. Заключительным этапом является оценка степени повреждения клеток. В конечном итоге, индуцированное растяжением повреждение эндотелиальных клеток мозга используется для моделирования повреждения гематоэнцефалического барьера in vitro.

Значение данной методики распространяется на терапию черепно-мозговых травм, поскольку она моделирует реальное воздействие, происходящее при ЧМТ на гематоэнцефалический барьер, с помощью механического растяжения эндотелиальных клеток мозга морской свинки. Процедуру продемонстрирует доктор Элейн Сальвадор, постдок из моей лаборатории. Начните выполнение данной процедуры с культивирования микрососудистых эндотелиальных клеток мозга морской свинки в культуральном флаконе T 75.

Меняйте среду дважды в неделю до достижения конфлюэнтности. Затем промойте клетки раствором PBS. После этого удалите PBS и трипсин.

Обработайте клетки двумя миллилитрами подогретого раствора трипсина-ЭДТА. Инкубируйте клетки при 37 °C в течение пяти минут или до тех пор, пока клеточный слой не диспергирует. После этого добавьте к клеткам восемь миллилитров культуральной среды и несколько раз постучите по флакону, чтобы отсоединить клетки.

Осмотрите клетки под микроскопом, чтобы убедиться в их полном откреплении от флакона. Затем несколько раз пропипетируйте среду с открепленными клетками. После этого осторожно перемешайте суспензию клеток, вращая флакон.

Добавьте 20 µL суспензии клеток в гемоцитометр и подсчитайте количество клеток. Определите плотность клеток и доведите её до 20 000 клеток на квадратный сантиметр в лунке. Затем перенесите суспензию клеток в коллаген.

В лунки шестилуночного планшета с гибким дном внесли культуру в общем объеме 3 mL на лунку. Смену питательной среды проводили дважды в неделю; клетки культивировали при 37 °C в течение одной недели до достижения конфлюэнтности.

Для дифференцировки клеток замените культуральную среду на среду для дифференцировки и инкубируйте клетки при 37 °C в течение 24 часов. В данной процедуре включите устройство управления повреждением клеток, установите задержку на 50 мс. Затем установите давление регулятора на 15 PSI и нажмите на пусковой механизм несколько раз, пока регистрируемое пиковое давление не стабилизируется.

Затем установите давление регулятора на нужное значение. После этого поместите 6-луночный культуральный планшет с гибким дном в держатель лотка. Убедитесь, что селектор лунок установлен в соответствии с размером лунок.

Затем плотно установите адаптерный штекер, удерживая его одной рукой, а другой нажмите на пусковой механизм; зафиксируйте значение возникшего пикового давления. Сразу после этого поместите планшет обратно в инкубатор при 37 °C на нужное время или используйте его незамедлительно для последующих экспериментов или оценки повреждения от растяжения с помощью анализа поглощения красителя DI. Сразу после растяжения клеток добавьте к культуральной среде 30 µL красителя для определения жизнеспособности в концентрации 1 mg/mL, который служит маркером цитотоксичности.

Для оценки повреждения вследствие растяжения по выходу лактатдегидрогеназы: сразу после растяжения удалите 200 µL культуральной среды из лунки; повторите эту процедуру для каждой временной точки после повреждения, которую вы планируете включить в исследование выхода LDH. Затем центрифугируйте культуральную среду в микроцентрифуге на максимальных оборотах в течение пяти минут.

Чтобы удалить остатки клеточного дебриса, слейте супернатант и используйте его для последующих этапов. После отбора необходимых образцов из различных временных точек подвергните клетки лизису, используя раствор для лизиса, входящий в набор для анализа LDH. После этого добавьте по 100 µL среды для анализа из набора в каждую лунку прилагаемого 96-луночного планшета.

Затем добавьте 100 µL бесклеточной среды для культивирования клеток в две параллельные лунки 96-луночного планшета; инкубируйте планшет при 37 °C в течение 30 минут и измерьте оптическую плотность при 492 нм. Здесь представлено исследование нормальных и поврежденных клеток с помощью световой микроскопии.

Нормальный, нерастянутый сливной монослой клеток плотно упакован и имеет вытянутую форму; при растяжении клеток путем подачи пикового импульса давления от 1,8 до 2,0 PSI они выглядят менее компактными. При умеренном повреждении клеток пиковым импульсом давления от 2,5 до 3,0 некоторые из них выглядят набухшими и деформированными. При сильном растяжении от 3,5 до 4,5 PSI клетки сокращаются.

Ниже представлено исследование нормальных и поврежденных клеток с помощью флуоресцентной микроскопии. Окрашивание на жизнеспособность клеток проводили через два часа после повреждения. Здесь представлены контрольные нерастянутые клетки, клетки с умеренным растяжением и клетки с сильным растяжением.

На этом рисунке показано высвобождение фермента LDH в супернатант после растяжения; количество LDH, высвобожденного в культуральную среду, измеряли через различные промежутки времени после повреждения, вызванного растяжением, и выражали в процентах от общего количества высвобождаемой LDH. Показатели клеток, подвергнутых низкому и умеренному растяжению, существенно не отличались ни от показателей нерастянутого контроля, ни друг от друга.

Клетки, подвергшиеся сильному растяжению, высвободили значительно большее количество LDH по сравнению со всеми остальными образцами, за исключением образца с умеренным растяжением через один час после его возникновения. Этот метод открыл исследователям в области нейробиологии путь к изучению черепно-мозговой травмы в эндотелиальных клетках мозга морских организмов in vitro.