Высокая пропускная проточной цитометрии Клеточная Анализ для выявления антител к N-метил-D-аспартат рецепторов или допамин-2 рецепторов в сыворотке человека

Общая цель следующего эксперимента заключается в обнаружении нейрональных антител к D2R или NMDA-рецепторам в образцах пациентов с помощью высокопроизводительного клеточного анализа методом проточной цитометрии. Это достигается путем субклонирования полной последовательности кДНК человеческого D2R или NMDA-рецептора в плазмиду. На втором этапе проводится трансфекция линии клеток человека, что приводит к экспрессии нейрональных антигенов на поверхности клеток.

Затем трансфицированные клетки инкубируют с сывороткой пациента и соответствующими вторичными антителами перед проведением проточной цитометрии. Для обнаружения связывания антител с антигенами клеточной поверхности результаты получают на основе анализа методом проточной цитометрии. Наш высокопроизводительный трехпортовый клеточный анализ методом проточной цитометрии является быстрым, количественным и эффективным для исследования больших когорт образцов пациентов.

Это дает значительное преимущество по сравнению с использованием клеточного анализа с применением иммунохимии и конфокального анализа. Как правило, специалисты, только начинающие осваивать данный метод, сталкиваются с проблемой потери клеток в ходе эксперимента при попытке получить необходимое количество клеток для анализа на проточном цитометре. Будьте осторожны, чтобы не аспирировать клетки во время промывок.

Выберите экспрессионный вектор, подходящий для экспрессии трансмембранных белков и обеспечивающий раздельное клеточное ко-экспрессирование антигенов и зеленого флуоресцентного белка. Например, данный вектор содержит усовершенствованный репортер GFP под контролем внутреннего сайта посадки рибосомы. Субклонируйте полноразмерный человеческий CD NA в вектор с использованием соответствующих рестриктаз; после подтверждения клонов путем секвенирования создайте запасы плазмид, пригодных для использования при трансфекции культуры клеток HEK 2 93 в полной среде DMEM с 10% фетальной бычьей сыворотки.

Соберите клетки с помощью трипсина; после одного промывания центрифугируйте клетки и ресуспендируйте клеточный осадок в свежей полной среде DMEM. Подсчитайте количество клеток, затем посейте культуры в 6-луночные планшеты объемом 2 мл при примерно 70% конфлюэнтности. Распределите лунки с клетками HEK 293 для трансфекции экспрессионными конструктами, а также контрольным вектором. Оставьте часть нетрансфецированных клеток HEK 293 для последующей компенсации.

Приготовьте трансфекционные смеси, состоящие из 200 µL 0,9% раствора sodium chloride, 2,5 µg ДНК и полиэтилена в концентрации 4 µg/mL. Немедленно перемешайте на вортексе в течение 10 секунд и инкубируйте при комнатной температуре 10 минут, после чего добавьте трансфекционную смесь в каждую лунку, содержащую 2 mL свежей полной среды dmm. Накройте планшет, оберните края Parafilm и центрифугируйте при 280 ×g в течение пяти минут для облегчения трансфекции клеток.

Затем снимите парафильм и поместите планшет в условия культивирования на 18 часов. Замените культуральную среду на свежую полную среду DMEM и поддерживайте культуру еще в течение 72 часов. Для отсоединения клеток добавьте в каждую лунку 500 µL трипсина и инкубируйте примерно пять минут при 37 °C.

Затем ресуспендируйте клетки в каждой лунке в двух миллилитрах 2% FBS в PBS и после трехкратной промывки перенесите их в коническую пробирку. Ресуспендируйте клеточные осадки в растворе 2% FBS до концентрации 1 миллион клеток на миллилитр. Теперь составьте схему расположения образцов в 96-луночном планшете для проточной цитометрии таким образом, чтобы разные клеточные линии были обработаны каждым образцом пациента или первичным антителом.

Затем высейте по 50 000 клеток в каждую лунку V-образного 96-луночного планшета и осадите клетки центрифугированием при 450 Gs в течение пяти минут. Наклоните планшет под углом и осторожно удалите супернатант, стараясь не аспирировать осадок клеток. Далее добавьте серийные разведения первичных антител для оценки экспрессии антигена на поверхности.

Затем, для обнаружения антител в образцах пациентов, после трех промывок добавьте соответствующее вторичное антитело, конъюгированное с AF 647: антитела к IgG человека для образцов пациентов и антитела к IgG мыши для первичных антител, в 170 µL 2% раствора FBS; инкубируйте клетки в течение одного часа при комнатной температуре в темноте. Повторно инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре в темноте после трех промывок.

Резуспендируйте клетки в 35 µL 2% раствора FBS для последующего анализа на проточном цитометре. Сначала настройте высокопроизводительный пробоотборник. Соберите данные по 10 000 событий на лунку в соответствии с шаблоном сбора данных для проточной цитометрии.

Экспортируйте данные, а затем проанализируйте их с помощью программного обеспечения для проточной цитометрии: выделите популяцию живых клеток HEK 2 93 на основе прямого и бокового светорассеяния. Также установите гейт на высокую экспрессию GFP, чтобы анализировать только трансфицированные клетки. Определите среднюю интенсивность флуоресценции в канале AF 6 47 для живых GFP-положительных клеток.

Затем экспортируйте данные в Excel или Prism для анализа. Постройте график зависимости концентраций первичных антител от MFI, полученных в соответствующих образцах для каждого пациента и контрольного образца. Определите дельту MFI и рассчитайте порог положительного результата по антителам, прибавив три стандартных отклонения к среднему значению дельты MFI контрольной группы.

Затем нанесите отдельные образцы на график, сгруппировав их по группам пациентов. Обозначьте пороговое значение в виде линии. Клетки, экспрессирующие либо NMDA-рецептор, либо дофаминовый D2-рецептор, были отобраны на проточном цитометре с использованием высокопроизводительного пробоотборника.

В ходе анализа клетки отбирали с помощью гейтирования по параметрам прямого светорассеяния (для определения размера) и бокового светорассеяния (для определения гранулярности). Трансфицированные клетки HEK 293 экспрессировали репортерную молекулу GFP в цитоплазме; нетрансфицированные клетки исключались из анализа путем выделения гейта GFP-положительных клеток. Для устранения фоновой флуоресценции при анализе сывороток крови человека измеряли MFI, связанную со связыванием вторичных антител к IgG человека, конъюгированных с AF 647.

Значение delta MFI было рассчитано путем вычитания фонового MFI контрольных клеток. Данный метод анализа клеток с помощью проточной цитометрии основан на антительном определении интересующего антигена на поверхности клеток. Например, клетки GK 2 93, трансфицированные экспрессионной плазмидой для N-M-D-A-R, продемонстрировали высокий уровень экспрессии поверхностного N-метил-D-аспартат-рецептора.

Аналогичным образом, клетки, трансфицированные D2R, экспрессировали дофаминовый рецептор 2-го типа, тогда как контрольные клетки не экспрессировали ни один из этих антигенов. В данном клиническом исследовании оценивались когорта пациентов с NMDA-рецепторным энцефалитом, когорта пациентов с энцефалитом, связанным с антителами к D2R, и контрольная когорта с другими невоспалительными неврологическими заболеваниями. Следует отметить, что ни у одного из серопозитивных пациентов не было выявлено двойной положительной реакции на антитела.

Нацеливание на N-M-D-A-R и D2R прошло в соответствии с ожиданиями. Антитела к N-M-D-A-R и D2R не были обнаружены ни в одном из проанализированных контрольных образцов. После освоения эта методика может быть правильно выполнена за пять часов, включая один час сбора данных проточной цитометрии примерно для 80 образцов после ее разработки.

Этот метод открыл исследователям в области нейроиммунологии путь к обнаружению новых мишеней для антител при иммуноопосредованных заболеваниях.