Высокая пропускная проточной цитометрии Клеточная Анализ для выявления антител к N-метил-D-аспартат рецепторов или допамин-2 рецепторов в сыворотке человека

Общая цель данного эксперимента заключается в обнаружении нейрональных антител против D-2 R или N-M-D-A-R в образцах пациентов с помощью высокопроизводительного клеточного анализа методом проточной цитометрии. Это достигается за счет субклинга, полной последовательности CDNA человеческого D двух R или N-M-D-A-R в плазмиде. В качестве второго шага происходит трансфициация клеточной линии человека, что приводит к экспрессии нейрональных антигенов на клеточной поверхности.

Затем трансфицированные клетки инкубируют с сывороткой пациента и соответствующим вторичным антителом перед получением проточной цитометрии. Для выявления связывания антител с антигенами клеточной поверхности получают результаты на основе анализа проточной цитометрии. Наш клеточный анализ с высоким трехпортовым потоком цитометрии является быстрым, количественным и эффективным для больших когорт образцов пациентов.

Это является существенным преимуществом по сравнению с использованием клеточного анализа с иммунохимией и конфокальным анализом. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут бороться с потерей клеток в течение эксперимента, чтобы получить соответствующее количество клеток на проточном цитометре. Следите за тем, чтобы клетки не аспирировались между промывками.

Выберите вектор экспрессии, который подходит для экспрессии трансмембранных белков и обеспечивает клеточную коэкспрессию антигенов и зеленого флуоресцентного белка по отдельности. Например, этот вектор имеет усиленный репортер GFP под контролем внутреннего сайта входа рибосом, субклонировать CD NA человека по всей длине в вектор с использованием соответствующих ферментов рестрикции, после верификации клонов методом секвенирования, сделать запасы плазмид, пригодных для использования в трансфектной культуре. HEK 2 93 клетки в полном DMEM с 10% фетальной бычьей сывороткой.

Соберите клетки с помощью трипсина, после одной промывки центрифугируйте клетки и восстановите суспензию клеточной гранулы в свежем комплектном дмм. Подсчитайте клетки, затем засейте два миллилитровых культиватора в шесть луночных планшетов при беглости около 70% Co, назначьте лунки HEK 2 93 клеток для трансфекции с помощью экспрессионных конструкций, а также контрольного вектора. Оставьте некоторое количество на трансфицированных клетках HEK 2 93 для компенсации в дальнейшем.

Приготовьте трансфекционные смеси, состоящие из 200 микролитров 0,9% хлорида натрия, 2,5 микрограмма ДНК и четырех микрограммов на миллилитр полиэтилена. Немедленно взбейте Vortex в течение 10 секунд и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут, прежде чем добавить трансфекционную смесь в каждую лунку по два миллилитра свежего полного дмм. Накройте пластину, оберните боковые стороны перфилом и центрифугируйте при 280 GS в течение пяти минут, чтобы облегчить трансфекцию клеток.

Затем снимите пара-пленку и поместите пластину в условия культивирования на 18 часов. Замените питательную среду свежим полным DM EM и выдержите в культуре еще 72 часа. Чтобы отделить клетки, добавьте 500 микролитров вариса в каждую лунку и инкубируйте примерно пять минут при температуре 37 градусов Цельсия.

Затем повторно суспендируйте клетки каждой лунки в двух миллилитрах 2%FBS в PBS и перенесите клетки в коническую трубку после трех промывок. Ресуспендируйте поддоны ячеек из расчета 1 миллион ячеек на миллилитр в 2% растворе FBS. Теперь разработайте 96-луночный шаблон для получения данных проточной цитометрии таким образом, чтобы различные клеточные линии обрабатывались каждым образцом пациента или первичным антителом.

Затем засейте 50 000 клеток на лунку в 96-луночной пластине с V-образным дном, окатывают клетки центрифугированием при 450 G в течение пяти минут. Наклоните пластину под углом и аккуратно удалите наднатин, стараясь не аспирировать клеточную гранулу. Затем добавьте серийное разведение первичного антитела для оценки поверхностной экспрессии антигена.

А затем образцы пациента с целью обнаружения антител, инкубируют клетки в течение одного часа при комнатной температуре в темноте после трех промывок в 170 микролитрах 2%-ного раствора FBS, добавляют соответствующие AF 6 47 конъюгированные вторичные антитела против человеческого IgG для пациента и анти-УЗИ. IgG для первичных антител. Гибридизируйте в течение одного часа при комнатной температуре в темноте после трех стирок.

Резус суспендирует клетки в 35 микролитрах 2%-ного раствора FBS для получения клеток проточной цитометрии на проточном цитометре. Сначала настройте высокопроизводительный пробоотборник. Регистрируйте 10 000 событий на лунку в соответствии с шаблоном регистрации проточной цитометрии.

Экспортируйте, а затем анализируйте данные с помощью программного комплекса проточной цитометрии на живых клетках HEK 2 93 на основе прямых внутренних рассеиваний. Также при высоком положительном GFP для анализа только трансфицированных клеток. Определите среднюю интенсивность флуоресценции канала AF 6 47 в живых GFP-положительных клетках.

Затем экспортируйте данные в Excel или призму для анализа. Построить график зависимости концентраций первичных антител от MFI, полученных из соответствующих образцов для каждого пациента и контрольного образца. Определите дельта-МФИ: рассчитайте порог положительности антител путем сложения трех стандартных отклонений выше среднего дельта-МФИ контрольной когорты.

Затем нанесите на график отдельные образцы, сгруппированные в соответствии с группой пациентов. Здесь порог представлен в виде линии. Клетки, экспрессирующие либо рецептор n метилдеаспартата, либо рецептор дофамина 2, были получены на проточном цитометре с использованием высокопроизводительного пробоотборника.

В ходе анализа ячеек стробировали на основе прямого разброса по размеру и по боковому разброса для зернистости. ТРАНСФИЦИРОВАННЫЕ HK 2 9 3 клетки экспрессировали репортерную молекулу GFP в цитоплазме, а трансфицированные клетки UNT были исключены из анализа в пределах положительной походки GFP. MFI, ассоциированный с AF 6 47, конъюгированным связыванием вторичных антител IgG человека измеряли с целью устранения фоновой флуоресценции при анализе сывороток человека.

Дельта MFI рассчитывалась путем вычитания фонового MFI контрольных ячеек. Этот клеточный анализ на основе проточной цитометрии основан на обнаружении антител на основе антигена клеточной поверхности, представляющего интерес. Например, клетки GK 2 93, трансфицированные экспрессирующей плазмидой для N-M-D-A-R, показали высокую экспрессию поверхностного и метильного рецептора.

Аналогичным образом, клетки, трансфицированные D-2 R, экспрессировали рецептор дофамина-2, в то время как контролируемые клетки не экспрессировали ни один из этих антигенов. В этом клиническом исследовании оценивали когорту пациентов с энцефалитом N-M-D-A-R, когорту пациентов с энцефалитом, ассоциированным с антителами D two R, и контрольную когорту с другими невоспалительными неврологическими заболеваниями. Обратите внимание, что ни у одного из положительных пациентов не было дважды положительного результата на антитела.

Нацеливание на N-M-D-A-R-M-D на два R, как и ожидалось. Антитела N-M-D-A-R и D two R не были обнаружены ни в одном из проанализированных контрольных групп. После освоения эта техника может быть выполнена в течение пяти часов с одним часом захвата потока примерно для 80 образцов после ее разработки.

Этот метод проложил путь исследователям в области нейроиммунологии к открытию новых мишеней антител при иммуноопосредованных расстройствах.