Исследование рецептор-лигандных систем целлюлозосомы с помощью одномолекулярной силовой спектроскопии на основе АСМ

Общей целью данного эксперимента является изучение механических свойств и сворачивающих состояний партнеров по связыванию слитых белков с помощью спектроскопии одиночных молекул на основе FM. Это достигается путем ковалентной иммобилизации партнеров по связыванию белков на предметном стекле и на консольном стекле A FM для достижения четко определенной геометрии вытягивания в качестве второго шага. Поверхность стекла имеет вдавливание с помощью кантилевера, что позволяет установить связывание рецепторного лиганда.

Затем кантилевер втягивается с постоянной скоростью для того, чтобы развернуть отдельные белковые домены и связать комплекс рецепторного лиганда Получены результаты, которые выявляют третичные структурные элементы, действующие как энергетические барьеры вдоль пути развертывания, которые выявляются в моделях эластичности полимеров. Дополнительная кинетическая и энергетическая информация о партнерах по связыванию может быть получена путем подгонки кинетических моделей к динамическому спектру сил. Общая цель этой процедуры заключается в изучении разворачивающихся путей белков под действием силы.

Этот метод может дать представление о механической стабильности белков. Он может быть применен к любой системе лигандов белковых рецепторов, которая может быть сконструирована с помощью доступной файловой группы. Исследователи, использующие этот метод впервые, испытывают трудности, потому что время имеет решающее значение, а работа с консолями может быть сложной.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биофизики, например, как многодоменный белок разворачивается с самого начала. Стеклянная крышка диаметром два на 24 миллиметра и толщиной 0,5 миллиметра вставляется в держатель A-P-T-F-E, а затем подвергается ультразвуковой обработке. Крышка погружается в смесь этанола и сверхчистой воды в соотношении 50 на 50 в течение 15 минут.

Когда ультразвуковая обработка будет завершена, промойте покровные листы сверхчистой водой и протравите их в растворе пираньи в течение 30 минут. Через 30 минут снимите покровные листы, промойте их сверхчистой водой и высушите под слабой струей азота. Затем погружайте крышку в смесь ультрачистой воды этанола в соотношении 45 к пяти к одному.

Поместите погружные образцы на шейкер при комнатной температуре на 60 минут со скоростью примерно 50 оборотов в минуту. Затем последовательно окуните крышку в 100% этанол, а затем в сверхчистую воду два раза. Снова просушите укрытие под слабой струей азота.

После высыхания запекайте чехол в духовке при температуре 80 градусов Цельсия в течение 30 минут. Храните неиспользованные защитные стекла под Аргоннской областью до шести недель для проведения аминоизации силиконовых наконечников кантилеверов. Сначала поместите четыре силиконовые консоли на чистое предметное стекло и обработайте их ультрафиолетовым озоном в течение 15 минут.

Затем погрузите консоли на три минуты и раствор этанола 50 на 50 и три аминопропилдиметилоксиса Ilene, вместе с точкой 25% сверхчистой воды. Далее последовательно промойте консоли в течение 60 секунд в пекарнях из толуола, этанола и сверхчистой воды. Тщательно высушите консоли на фильтровальной бумаге между RINs после окончательного ополаскивания.

Поместите консоли на чистую стеклянную горку и запекайте их при температуре 80 градусов Цельсия в течение 30 минут. Приготовьте две T гранул для восстановления сульфида TEP diss, сначала отрезав наконечник пипетки объемом 200 микролитров, чтобы увеличить его диаметр, а затем впрыскав 100 микролитров исходного раствора в каждую микропробирку объемом 1,5 миллилитров. Затем добавьте один миллилитр TBS в суспензию суспензии из ТЭП и промойте шарики, кратковременно протерев микротрубку.

Затем гранулируйте шарики, центрифугируя образцы при давлении 850 G в течение трех минут. Осторожно извлеките и выбросьте надосадочную жидкость с помощью микропипетки и еще дважды промойте шарики одним миллилитром TBS. Центрифугирование между полосканиями происходит после окончательного ополаскивания, добавьте концентрированный белковый раствор в дозе три миллиграмма на миллилитр в соотношении один к двум и аккуратно перемешайте суспензию, помешивая наконечником микропипетки, чтобы избежать введения пузырьков воздуха.

Затем поместите белковую смесь из гранул ТЭП на вращатель на 2,5 часа. Замочите аминоглазые консоли и покровные стекла в буфере батата натрия при pH 8,5 на 45 минут, чтобы детонировать первичные аминные группы на поверхности. Затем нагрейте порошок малама N-H-S-P-E-G до комнатной температуры и приготовьте 210 микролитров его при концентрации 25 микромоляров, смешав его в буфере с натриевым мальчиком восемь.

Раствор следует использовать как можно быстрее из-за чрезвычайно короткого периода полувыведения NHS. При pH 8,5 быстро нанесите 30 микролитров капель раствора малама N-H-S-P-E-G на чашку Петри и 90 микролитров на каждую вторую стеклянную крышку. Осторожно поместите консоли внутрь капель объемом 30 микролитров.

Затем переверните крышку без капли на крышку с раствором N-H-S-P-E-G malam, чтобы образовался сэндвич с раствором N-H-S-P-E-G MALAM. В середине инкубируйте консоли и накройте стекла раствором N-H-S-P-E-G MALAM при комнатной температуре в течение одного часа. Центрифугируйте шарик ТЭП и раствор восстановленного белка при 100 GS в течение одной минуты и соберите снейт.

Затем разбавьте раствор белка TBS. Стремитесь к концентрации белка во время поверхностной конъюгации в диапазоне от 0,5 до двух миллиграммов на миллилитр. Затем отставьте восстановленные и разбавленные белковые растворы в сторону на несколько минут, пока промывайте консоли и покровные стекла.

Промойте покровные стекла в трех последовательных стаканах сверхчистой водой. Удалите остатки жидкости с чехлов, осторожно коснувшись краев фильтрующей бумаги. Затем установите защитные стекла в соответствующий держатель образца, совместимый с прибором A FM, и высушите остаточную жидкость под слабой струей азота.

Нанесите 20 микролитров разбавленного белкового раствора в виде капли на центр покровных стеблей. Затем промойте консоли в трех последовательных стаканах сверхчистой водой, после чего добавьте 30 микролитров капель второго разведенного белкового раствора. Пегилированные покровные стекла и консоли инкубировать с соответствующими разбавленными белковыми растворами при комнатной температуре в течение одного-двух часов во влажной камере.

Затем с помощью пипетки прополощите крышки не менее 10 раз одним миллилитром TBS, а затем храните их в TBS до проведения измерения. Также промойте консоли с помощью трех последовательных стаканов, содержащих TBS, чтобы удалить несвязанные белки и сохранить их в TBS. Установите функционализированные, консольные и стеклянные стекла в модель A FM, которая подходит для измерений в жидкостях и поддерживает доступный диапазон скоростей на Z-пьето примерно от 200 до 5 000 нанометров в секунду.

При монтаже банки свести к минимуму воздействие воздуха, убедитесь, что поверхности остаются покрытыми буфером в течение всего процесса при правильной настройке лазерного луча. Дайте системе уравновеситься не менее 30 минут, чтобы уменьшить любые эффекты дрейфа и при необходимости выполнить повторную регулировку. Затем приступают к проведению измерений при успешном связывании когезии.

Docker в паре с записанными силовыми трассами расстояний, показанными здесь. Демонстрируют характерный пиковый рисунок. Каждый пик в следовании представляет собой развертывание одного белкового субдомена, причем последний пик соответствует диссоциации рецепторного лигандного комплекса.

Записанные трассы расстояния силы затем были преобразованы в пространство длины контура силы и собраны в гистограмму положения барьера. Данные показывают приращение длины контура примерно на 89 нанометров, которое можно однозначно отнести к развертыванию домена xin для исследования энергетического ландшафта связного докера и взаимодействия. Всего было получено 186 трассировок данных при четырех различных скоростях объединения.

Результирующий спектр динамических сил, показанный в виде больших синих кругов, представляет собой наиболее вероятные силы разрыва при заданной скорости нагружения. Затем эти значения были подогнаны к модели Белла Эванса, подгонка дала значения для Коффа и дельты X, которые были признаны хорошо согласующимися с ранее опубликованными результатами. После освоения экспериментальная часть этой техники может быть выполнена за восемь-девять часов.

После этой процедуры сайт-специфический мутагенез может быть выполнен в последующем эксперименте для определения аминокислот, имеющих решающее значение для связывания после его развития. Этот метод проложил путь исследователям в области биофизики одиночных молекул к изучению ландшафтов сворачивания белка. Мы используем его для изучения механических свойств целлюлозных SOE, которые являются одними из самых механически стабильных белковых систем.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить одномолекулярную силовую спектроскопию на парах лигандов белковых рецепторов.