Изоляция миелоидных дендритных клеток и эпителиальных клеток из человеческого тимуса

Общая цель данной процедуры — выделение дендритных и эпителиальных клеток из тимуса человека. Это достигается путем первоначальной фрагментации препарированной ткани с помощью механического разрушения. Затем фрагменты ткани подвергаются дополнительному ферментативному перевариванию для получения суспензии одиночных клеток.

Наконец, суспензия клеток обогащается фракцией клеток низкой плотности с помощью сепарации в Перколле. В конечном итоге дендритные и эпителиальные клетки могут быть выделены из этой фракции с помощью магнитного или FACS-сортирования, либо их комбинации. Представленный нами метод обеспечивает эффективную, воспроизводимую и экономичную процедуру успешного выделения и последующего изучения редких популяций клеток, таких как дендритные и тимусные эпителиальные клетки, содержащиеся в тимусе человека.

И ротта, аспирант нашей лаборатории, продемонстрирует вам эту процедуру. Начните с помещения ткани тимуса в чашку Петри с инертным стерильным PBS комнатной температуры и промойте ее от остатков крови. Затем добавьте в чашку Петри свежий PBS и с помощью пинцета и ножниц удалите все сгустки крови, соединительную и жировую ткани, а также любые части ткани, которые выглядят нездоровыми.

После очистки ткани тимуса взвесьте ее для справки, затем нарежьте ткань на однородные кусочки размером один кубический сантиметр. Покройте кусочки PBS и поместите их на лед. Затем с помощью поршня стерильного шприца объемом от 10 до 20 миллилитров осторожно и быстро надавите на ткань, чтобы удалить основную массу тимоцитов и уменьшить общий объем ткани, подлежащей перевариванию.

Раствор станет заметно мутным. По мере высвобождения тимоцитов осторожно перемешайте содержимое чашки, затем с помощью стеклянного аспиратора удалите супернатант, содержащий тимоциты, стараясь не аспирировать случайно фрагменты ткани. Для этого может быть полезно использовать стерильный скребок для культур клеток, чтобы собрать все фрагменты ткани в одной стороне чашки, после чего наклонить чашку под углом 45 градусов и аспирировать оставшийся супернатант.

Промойте чашку свежим PBS и продолжайте собирать супернатант до тех пор, пока PBS не станет относительно прозрачным. Выполните финальную промывку RPMI, затем с помощью острых ножниц максимально мелко измельчите кусочки ткани — по крайней мере, до размера, позволяющего им пройти в пятимиллилитровую пипетку, чтобы изолировать дендритные клетки или dc. Сначала поместите до 10 г измельченных кусочков ткани в пробирки объемом 50 мл, добавив по 10 мл раствора коллагеназы с ДНК и 10 мл RPMI на каждые пять грамм ткани.

Затем инкубируйте суспензию ткани в течение 40 минут при медленном вращении в термоинкубаторе при температуре 37 °C. Раствор фермента станет мутным по мере высвобождения клеток. По окончании переваривания центрифугируйте клеточную суспензию в течение двух минут при 110 G и комнатной температуре для осаждения фрагментов ткани, соберите супернатант, а затем осадите клеточную суспензию.

На этот раз удалите супернадант и ресуспендируйте клетки в 10–50 миллилитрах полного RPMI. В зависимости от размера осадка определите количество жизнеспособных клеток с помощью метода исключения трипанового синего, затем поместите клеточную суспензию при 37 °C с неплотно закрытой крышкой для выделения тимусных эпителиальных клеток (TEC). Затем ресуспендируйте остатки ткани в 10 миллилитрах свежего раствора коллагеназы и ДНКазы, добавив 10 миллилитров RPMI и трипсина-ЭДТА.

Продолжайте переваривать фрагменты ткани в течение 40 минут при 37 °C при медленном перемешивании. За 10–15 минут до окончания инкубации добавьте сыворотку плода теленка в соотношении 1:5 для нейтрализации трипсина. После осаждения фрагментов ткани соберите супернатант и снова центрифугируйте клеточную суспензию.

Теперь осторожно аспирируйте и удалите супернатант, стараясь не задеть рыхлый осадок. После подсчета количества жизнеспособных клеток поместите эту клеточную суспензию также при 37 °C. Чтобы выделить фракцию клеток низкой плотности (LDF), начните с осаждения клеточных суспензий, ранее отложенных для обогащения DC и тех-клеток, пока остальные клетки центрифугируются.

Подготовьте градиент плотности Percoll с концентрацией 1,07 г/мл. Согласно данной таблице, ресуспендируйте оба осадка до концентрации 1×10⁹ клеток в 6 мл подготовленного раствора Percoll. Тщательно перемешайте клеточный раствор до получения гомогенной суспензии, затем перенесите растворы в поликарбонатные центрифужные пробирки Falcon объемом 50 мл с завинчивающимися крышками.

Затем с помощью пипетки медленно нанесите по 30 миллилитров полной среды RPMI в каждую пробирку поверх суспензии клеток perca. Осторожно, чтобы не перемешать слои, перенесите пробирки в предварительно охлажденную центрифугу с фиксированным углом наклона ротора и центрифугируйте клетки в течение 35 минут. Затем с помощью стерильных пастернаусов аккуратно перенесите обогащенные фракции клеток низкой плотности из интерфейса между клетками per и средой в пробирки объемом 50 миллилитров, содержащие холодную полную среду RPM.

Затем я заполняю пробирки дополнительной полной средой RPMI, чтобы разбавить оставшееся количество клеток на одну пробирку. Наконец, обогащенные клетки дважды промывают неполной средой RPMI, после чего осадок ресуспендируют в свежей среде и определяют количество жизнеспособных клеток. На этом первом рисунке показан довольно большой фрагмент ткани размером девять сантиметров, полученный от ребенка 6 лет, как было продемонстрировано ранее.

Важным первым шагом является очистка ткани от нежелательных компонентов. Как показано белыми стрелками, затем была получена суспензия единичных клеток ткани тимуса, которая была обогащена клетками фракции с низкой плотностью. В то время как типичная суспензия единичных клеток содержит примерно 3% H-L-A-D-R-положительных клеток после разделения в градиенте плотности, в крупноклеточной фракции этот процент увеличивается до 15–40%.

Фракция низкой плотности в составе фракции высокой плотности, которая состоит преимущественно из однородных малоразмерных тимоцитов. Такие клетки практически отсутствуют. Тимические.

Миелоидные дендритные клетки могут быть идентифицированы по экспрессии ряда поверхностных маркеров, включая CD 11 C. На данном рисунке показана эффективная изоляция CD 11 C-положительных клеток с использованием модифицированного протокола магнитного сепарирования клеток после выделения. Чистота CD 11 C-положительных ДК составила 93%, что было подтверждено иммуноокрашиванием изолированных клеток. В среднем выход изолированных CD 11 C-положительных клеток составляет от 5×10⁵ до 5×10⁶ миелоидных дендритных клеток на 10⁹ всего клеток тимуса.

В данной таблице представлены репрезентативные данные, полученные из нескольких индивидуальных образцов тимуса разного возраста и массы ткани с различным объемом исходных суспензий одиночных клеток; также указано общее количество клеток фракции с низкой плотностью, а также последующий выход и чистота CD 11 C-положительных клеток только во фракции, обогащенной антигенпрезентирующими клетками. Примерно 0,5% клеток представляют собой CD 45-низкие EPCA-положительные или CD 45-отрицательные EPAM-положительные кортикальные эпителиальные клетки; медуллярные эпителиальные клетки могут быть выделены из обогащенных стромальных клеток с низким или отсутствующим содержанием CD 45 после трипсинизации как EPAM-низкие CD R2-положительные и EPAM-высокие CD 2-отрицательные клетки соответственно. Выделение дендритных клеток и подмножеств тимусных эпителиальных клеток из человеческого тимуса.

Это процедура, чувствительная к времени. Чем быстрее проходит процесс отделения, тем лучше состояние клеток. После освоения данного протокола дендритные клетки могут быть выделены в течение пяти-шести часов, а эпителиальные клетки тимуса — в течение восьми-десяти часов.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как работать с тканью тимуса человека для успешного выделения дендритных клеток и эпителиальных клеток тимуса. Выделенные клетки затем могут быть использованы в различных последующих приложениях для дальнейшего изучения с целью более детальной характеристики клеток, а также для лучшего понимания их биологии.