Роман трехмерного течения палаты по изучению устройства хемокинами направлены Экстравазация клеток, циркулирующих в физиологических условиях потока

Общая цель следующего эксперимента заключается в количественном измерении миграции циркулирующих клеток по градиенту хемокинов. В условиях физиологического напряжения сдвига это достигается путем первоначального культивирования монослоя эндотелиальных клеток на микропористых вставках, покрытых коллагеном, с их последующей установкой в проточную камеру, где они перекрывают отдельный статический отсек, содержащий хемокины. Затем на клетки воздействуют напряжением сдвига, чтобы имитировать физиологические условия в сосудистой системе.

На втором этапе исследуемые клетки, такие как стволовые клетки лейкоцитов или опухолевые клетки, помещаются в 3D-систему для циркуляции. Содержимое статического отсека влияет на эффективность взаимодействия между циркулирующими клетками и эндотелиальными клетками и, соответственно, на скорость трансмиграции исследуемых клеток через эндотелиальный слой. Затем 3D-система разбирается, и трансмигрировавшие исследуемые клетки собираются из нижнего статического отсека для количественного измерения миграции клеток с использованием различных современных методов; в результате полученные данные демонстрируют способность циркулирующих исследуемых клеток взаимодействовать с эндотелиальными клетками в условиях физиологического потока и выходить из кровотока в зависимости от концентрации хемокинов в статическом отсеке.

Основное преимущество данной методики по сравнению с существующими методами, такими как использование камер с параллельным ламинарным потоком и анализы статического переноса, заключается в том, что она сочетает в себе воздействие напряжения сдвига в верхнем отделении и хемокинов в нижнем статическом отделении. Это позволяет исследователям количественно оценить экстернализацию циркулирующих клеток в ответ на градиент хемокинов и условия физиологического потока. Данный метод также может быть использован для изучения влияния перекрестных взаимодействий между клетками локального микроокружения и эндотелиальными клетками на экстравазацию циркулирующих клеток.

С помощью добавления дополнительного слоя клеток на отдельный вкладыш под эндотелиальными клетками процедуру продемонстрирует Валентина Агpова, техник моей лаборатории. Для начала рассчитайте количество вкладышей, необходимых для эксперимента, и поместите каждый вкладыш в отдельную стерильную чашку Петри. Стерилизуйте их гамма-облучением до достижения общей дозы 11 gray в зависимости от индивидуальных настроек.

Затем разведите стоковый раствор коллагена 1-го типа до концентрации 50 µg/mL, используя 0,01 M соляную кислоту, хранимую при температуре 4 °C, и приготовьте аликвоты конечного раствора объемом 154 µL для каждого вкладыша. Затем нанесите несколько капель раствора на поверхность вкладыша по кругу.

Затем добавьте оставшуюся часть аликвоты, чтобы на поверхности вставки образовалась одна большая капля. Следите за тем, чтобы наконечник пипетки нигде не касался вставки и чтобы коллаген покрывал всю поверхность вставки, но не стекал с нее. После того как вставка будет покрыта, закройте чашку Петри крышкой и осторожно поместите ее на ровную поверхность.

Инкубируйте вставки в течение одного часа при комнатной температуре, затем после инкубации аспирируйте коллагеновый раствор и промойте мембрану 160 µL PBS. Затем аспирируйте PBS. Закройте крышку и оберните чашку параформом.

Если вставки будут использоваться в тот же день, поместите чашку Петри в сухое место при комнатной температуре. В противном случае храните чашку при температуре 4 °C и используйте вставку в течение семи дней. Соберите культивируемые эндотелиальные клетки пупочной вены человека непосредственно перед использованием и ресуспендируйте их в соответствующей питательной среде из расчета 2,5 миллиона клеток на миллилитр.

При подсчете клеток убедитесь, что жизнеспособность клеток превышает 98% с использованием трипанового синего, затем добавьте 160 µL клеточной суспензии на каждый вкладыш. Сначала нанесите несколько маленьких капель по кругу на поверхность вкладыша, покрытого коллагеном, а затем осторожно добавьте оставшуюся часть клеточной суспензии, чтобы образовалась одна большая капля. По завершении закройте крышки и осторожно поместите чашки в инкубатор с 5% CO2 при 37 °C и инкубируйте в течение 30 минут, чтобы клетки прикрепились к мембране.

Через 30 минут извлеките планшеты из инкубатора и аккуратно добавьте по пять миллилитров предварительно подогретой культуральной среды на каждый вкладыш. При этом следите за тем, чтобы вкладыш оставался на дне чашки и был полностью покрыт средой. Затем закройте крышки и осторожно поместите чашки обратно в инкубатор.

Клетки инкубировали при 37 °C в течение ночи. Для сборки проточной камеры сначала скрутите между собой верхнюю и нижнюю пластины. Затем подсоедините пластины к блоку газообмена, используя ПВХ-трубки с внутренним диаметром 1,42 мм и толщиной стенок 0,8 мм.

Затем поместите собранное устройство в чистый пластиковый пакет и стерилизуйте его гамма-облучением до достижения общей дозы 11 gray. Следующим шагом извлеките лоток инкубатора, поместите его в стерильный ламинарный шкаф для культур тканей и простерилизуйте 70% ethanol. Затем накройте лоток большой стерильной салфеткой.

Затем извлеките устройство из пластикового пакета и поместите его на стерильный лоток инкубатора. После этого подключите устройство к перистальтическому насосу и настройте его на скорость потока 0.2 milliliters per minute. Пипеткой перенесите от пяти до семи milliliters желаемой питательной среды в стерильную пробирку объемом 15 milliliters, которая будет использоваться в качестве входного резервуара.

Затем отсоедините входную трубку от выходного отверстия, вытянув металлическую иглу из трубки с помощью небольших стерильных салфеток для сохранения стерильности трубки; поместите металлическую входную иглу в пробирку объемом 15 мл со средой, а выходную трубку — в пустую пробирку объемом 15 мл. Далее включите насос так, чтобы поток был направлен против часовой стрелки. Дождитесь, пока отрицательное давление втянет среду из входной пробирки объемом 15 мл в трубку, и остановите насос, когда среда достигнет конца трубки непосредственно перед ее входом в устройство.

Затем откройте устройство, открутив фиксирующие пластины, и осторожно снимите верхнюю пластину. С помощью пипетки внесите от 1500 до 1550 µL среды в нижние лунки, убедившись, что количество среды достаточно для формирования полусферы, поднимающейся на один-два миллиметра над нижней пластиной. Затем перенесите подготовленные вставки из чашек Петри в лунки нижней пластины. Используя стерильный пинцет, убедитесь, что под вставками не осталось пузырьков воздуха, и аспирируйте излишки среды, появившиеся на поверхности нижней пластины.

Затем установите верхнюю пластину обратно на нижнюю и соедините их. Закрутив винты, немедленно включите перистальтический насос и пропустите среду через 3D-устройство. Приподнимите выходной конец устройства и удерживайте камеру в этом положении, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха в пространстве между пластинами.

Продолжайте заполнять среду в трубке, соединяющей камеру с блоком газообмена, до тех пор, пока она не достигнет блока газообмена. Затем внесите три миллилитра среды в блок газообмена. Включите насос и дайте пузырькам воздуха выйти через него.

Поднимите блок, чтобы среда заполнила выходящую из него трубку, и остановите насос, когда среда останется в двух-трех сантиметрах до конца. После полного заполнения соедините входную иглу с выходной трубкой, используя небольшие стерильные салфетки. Затем измените направление работы насоса так, чтобы среда текла по часовой стрелке в сторону блока газообмена, и убедитесь, что все оставшиеся пузырьки воздуха удалены.

Снова запустите насос в противном направлении. Добавьте 100 µL суспензии тестовых клеток в блок газообмена. Затем закройте крышку респиратора.

Поместите лоток обратно в инкубатор и обеспечьте циркуляцию исследуемых клеток в устройстве при 37 °C. По истечении необходимого времени извлеките лоток с работающей системой из инкубатора и поместите его в ламинарный шкаф. Остановите насос, отсоедините входной и выходной каналы и поместите их концы в пустые стерильные пробирки объемом 15 мл.

Затем включите насос и соберите суспензию клеток из системы. Поместите суспензию клеток на лед до дальнейшего использования. Далее разберите камеру, открутив винты и сняв верхнюю пластину.

Извлеките вкладыши из нижней пластины и перенесите их в чашки Петри для окрашивания или сбора клеток. В завершение удалите суспензию клеток из нижних лунок и перенесите ее в пробирки объемом 15 мл. Дважды промойте каждую лунку 1,5 мл среды и добавьте промывочный раствор в соответствующую пробирку.

Затем центрифугируйте пробирки в течение пяти минут при 200 Gs и обработайте клетки в соответствии с конкретными целями эксперимента, такими как те, что указаны в прилагаемом текстовом протоколе. Ниже приведен пример одного из многих тестов, которые могут быть проведены с использованием данной системы. Установка представляет собой зеркальное расположение эндотелиальных клеток костного мозга, выращенных на вставках с порами размером пять микрон; под вставки добавляли фактор стволочных клеток 1 (SDF-1) в концентрациях 0, 5 или 50 ng/mL.

Клеткам костного мозга давали циркулировать в 3D-системе. Клетки, мигрировавшие через вставку, собирали и затем культивировали на планшетах со средой с метилцеллюлозой. В присутствии гемопоэтических факторов роста, стимулирующих формирование колоний клетками-предшественниками, через 14 дней подсчитывали количество колоний, чтобы определить число предшественников в каждой лунке и выявить их способность к миграции в сторону sdf.

Один — в условиях физиологического кровотока. При добавлении стромальных фибробластов, выращенных на нижнем вкладыше в статической камере, из кровотока в камеру мигрировало больше гемопоэтических клеток при добавлении SDF-1 в концентрации 50 нг/мл, чем при использовании только SDF-1. После своей разработки этот метод открыл исследователям в различных областях медицинских и биологических наук возможность моделировать тканеспецифичные сосудистые русла in vitro и изучать клеточные и молекулярные механизмы, опосредующие миграцию циркулирующих клеток в нормальные ткани по сравнению с пораженными.