Роман трехмерного течения палаты по изучению устройства хемокинами направлены Экстравазация клеток, циркулирующих в физиологических условиях потока

Общая цель данного эксперимента заключается в количественном измерении циркуляционных клеток в направлении хемокинового градиента. В условиях абсолютного физиологического стресса это достигается путем сначала культивирования монослоя эндотелиальных клеток на микропористые вставки, покрытые коллагеном, а затем их сборки в проточную камеру, где они покрывают отдельный статический отсек, содержащий хемокины. Затем к клеткам прикладывается напряжение сдвига, чтобы имитировать физиологические условия в сосудистой системе.

В качестве второго этапа теста представляющие интерес клетки, такие как лейкоциты, стволовые клетки или опухолевые клетки, могут циркулировать в 3D-системе во время циркуляции. Содержимое статического компартмента влияет на эффективность взаимодействия между циркулирующими клетками и эндотелиальными клетками, а затем на скорость трансмиграции тестируемых клеток через эндотелиальный слой. Далее 3D-система разбирается и трансмигрировавшие тестовые клетки собираются из нижнего статического компартмента с целью количественного измерения клеточности с использованием различных современных методов, получены результаты, показывающие способность циркулирующих тестовых клеток взаимодействовать с эндотелиальными клетками в условиях физиологического течения и выходить из кровотока на основе концентрации хемокинов в статическом компартменте.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как использование параллельных камер проточного листа и анализов статического переноса, заключается в том, что он сочетает в себе как напряжение she в верхнем компартменте, так и кины в нижнем статическом компартменте. Это позволяет исследователям количественно измерять экстернализацию циркулирующих клеток в зависимости от кин-градиента и условий физиологического потока. Этот метод также может быть использован для изучения влияния перекрестных помех между клетками локального микроокружения и эндотелиальными клетками на экстравазацию циркулирующих клеток.

Помогая дополнительному слою клеток на отдельной вставке ниже эндотелиальных клеток, демонстрируя процедуру, будет Валентина против ровы, лаборант из своей лаборатории. Для начала подсчитайте количество вкладышей, необходимых для эксперимента, и поместите каждую вставку в отдельную стерильную чашку Петри. Стерилизуйте их с помощью гамма-облучения до тех пор, пока общая доза не достигнет 11 грей в зависимости от индивидуальных установок.

Затем разведите запас коллагена. Наберите один раствор по 50 микрограмм на миллилитр, используя 0,01 молярной соляной кислоты, хранящейся при четырех градусах Цельсия, и приготовьте 154 микролитра конечного раствора для каждой вставки. Далее нанесите несколько капель из одной Eloqua на поверхность вставки по кругу.

Затем добавьте оставшуюся аликвоту, чтобы образовалась одна большая капля на поверхности вставки. Следите за тем, чтобы наконечник пипетки ни в коем месте не касался вкладыша и чтобы коллаген покрывал всю поверхность вкладыша, но не стекал. Как только вкладыш будет закрыт, накройте чашку Петри крышкой и осторожно положите ее на ровную поверхность.

После инкубации инкубируйте вкладыши в течение одного часа при комнатной температуре, отсадите раствор коллагена и промойте мембрану 160 микролитрами PBS. Затем аспирируйте PBS. Закройте крышкой и оберните блюдо параформом.

Если вкладыши будут использоваться в один и тот же день, поместите чашку Петри в сухое место при комнатной температуре. В противном случае поставьте блюдо при температуре четыре градуса Цельсия и используйте вкладыш в течение семи дней. Соберите культивируемые эндотелиальные клетки пупочной вены человека непосредственно перед использованием и повторно суспендируйте их в нужной питательной среде в концентрации 2,5 миллиона клеток на миллилитр.

При подсчете клеток убедитесь, что жизнеспособность клеток превышает 98%, используя триановый синий, затем добавьте 160 микролитров клеточной суспензии на каждую вставку. Сначала нанесите несколько небольших капель на поверхность вставки с коллагеновым покрытием по кругу, а затем осторожно добавьте остатки клеточной суспензии до образования одной большой капли. Когда закончите, закройте крышки и осторожно поместите посуду в инкубатор с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия и инкубируйте в течение 30 минут, чтобы клетки могли прикрепиться к мембране.

Через 30 минут достаньте пластины из инкубатора и аккуратно добавьте по пять миллилитров предварительно подогретой питательной среды поверх каждой вставки. Следите за тем, чтобы вставка оставалась на дне посуды и была полностью покрыта средой. Затем установите крышки на место и аккуратно поставьте посуду обратно в инкубатор культуры.

В ячейках температура 37 градусов по Цельсию на ночь. Чтобы собрать проточную камеру, сначала закрутите верхнюю и нижнюю пластины. Затем подсоедините пластины к газообменному узлу с помощью трубки из ПВХ диаметром 1,42 миллиметра со стенками толщиной 0,8 миллиметра.

Далее собранное устройство поместите в чистый полиэтиленовый пакет и простерилизуйте его методом гамма-облучения до тех пор, пока общая доза не достигнет 11 грей. Следующим шагом является снятие лотка инкубатора, помещение его в колпак для стерильных тканей и стерилизация 70% этанолом. Затем застелите противень большой стерильной салфеткой.

Далее извлеките устройство из полиэтиленового пакета и поместите его на стерильный лоток инкубатора. Затем подключите устройство к перистальтическому насосу и запрограммируйте его на работу со скоростью 0,2 миллилитра в минуту. Пипеткой нанесите пять-семь миллилитров желаемой питательной среды в стерильную 15-миллилитровую пробирку, которая будет использоваться для входа.

Затем отсоедините входную трубку от выпускной, вытянув металлическую иглу из трубки с помощью небольших стерильных салфеток для поддержания стерильности трубки, поместите металлическую входную иглу в 15-миллилитровую трубку со средой и поместите выходную трубку в пустую 15-миллилитровую трубку. Далее включите насос, чтобы поток шел против часовой стрелки. Позвольте отрицательному давлению втянуть среду из входной трубки объемом 15 миллилитров в трубку и остановите насос, когда среда достигнет конца трубки непосредственно перед тем, как она попадет в устройство.

Затем откройте прибор, открутив трубчатые пластины и осторожно извлеките из верхней пластины пипетку 1500 на 1,550 микролитра среды в нижние лунки, убедившись, что лунки содержат достаточное количество среды для формирования полусферы, которая достигает одного-двух миллиметров над нижней пластиной. Далее переложите подготовленные вкладыши из чашек Петри в углубления нижней тарелки. С помощью стерильных щипцов убедитесь, что под вставками не застряли пузырьки и не отсасывайте любую среду, которая появляется на поверхности нижней пластины.

Затем поместите верхнюю пластину обратно на нижнюю и снова соедините их. С помощью винтов сразу же включаем перистальтический насос и позволяем среде протекать через 3D устройство. Поднимите выпускной конец устройства и удерживайте камеру в этом положении, чтобы предотвратить образование пузырьков в пространстве между пластинами.

Продолжайте заполнять трубку, соединяющую камеру с газообменным узлом, средой до тех пор, пока она не достигнет газообменного блока. Далее поместите в газообменный агрегат три миллилитра среды. Включите насос и дайте пузырькам воздуха выйти через него.

Поднимите устройство, чтобы среда заполнила трубку, которая выходит из него, и остановите насос, когда среда находится за два-три сантиметра до конца. После полного заполнения подсоедините входную иглу к выпускной трубке с помощью небольших стерильных салфеток. Затем включите насос в обратном направлении, чтобы среда текла по часовой стрелке к газообменному узлу, и убедитесь, что все оставшиеся пузырьки воздуха удалены.

С помощью насоса снова течет против часовой стрелки. Добавьте 100 микролитров суспензии тестовой ячейки в газообменный узел. Затем закройте крышку респиратора.

Поместите лоток обратно в инкубатор и дайте тестовым клеткам циркулировать в устройстве при температуре 37 градусов Цельсия. Как только нужное время пройдет, извлеките лоток с рабочей системой из инкубатора и поместите его в колпак. Остановите насос, отсоедините входное и выходное отверстия и поместите концы в пустые стерильные пробирки объемом 15 миллилитров.

Затем включите насос и соберите клеточную суспензию из системы. Поместите клеточную суспензию на лед до использования. Далее разберите камеру, сняв винты и сняв верхнюю пластину.

Снимите вкладыши с нижней пластины и переложите их в чашки Петри для окрашивания или сбора клеток. Наконец, удалите клеточную суспензию из нижних лунок и поместите ее в 15-миллилитровые пробирки. Промойте каждую лунку дважды 1,5 миллилитрами среды и добавьте ее в соответствующую пробирку.

Затем центрифугируйте пробирки в течение пяти минут при давлении 200 G и обрабатывайте клетки в соответствии с конкретными экспериментальными целями, перечисленными в прилагаемом текстовом протоколе, показанном на рисунке. Вот пример одного из многих тестов, которые можно провести с помощью этой системы. Установка состоит из зеркального отражения эндотелиальных клеток, полученных из костного мозга, выращенных на вставках с пятью микронными порами ниже вставок, был добавлен фактор 1 из стромальных клеток или SDF 1 в концентрациях ноль, пять или 50 нанограммов на миллилитр.

Клеткам костного мозга было позволено циркулировать в 3D-системе. Клетки, которые мигрировали через вкладыш, собирали, а затем культивировали на планшетах с метилцеллюлозной средой. В присутствии гемопоэтических факторов роста, вызывающих образование колоний клеток-предшественников, количество колоний подсчитывалось через 14 дней, чтобы определить количество предшественников в каждой лунке и выявить их способность мигрировать в сторону SDF.

Один в условиях физиологического течения. При добавлении стромальных фибробластов, выращенных на нижней вставке в статической камере, больше гемопоэтических клеток мигрировало из кровотока в камеру с добавлением SDF, один из которых составлял 50 нанограммов на миллилитр, чем при использовании только одного SDF. Этот метод проложил путь исследователям в различных областях медицинских и биологических наук к моделированию тканевых специфических сосудистых русла in vitro и изучению клеточных и молекулярных механизмов, опосредующих миграцию циркулирующих клеток к нормальным тканям по сравнению с больными.