Генно-экологические модели взаимодействия для разоблачения механизмов восприимчивости при болезни Паркинсона
7 января 2014 г.
Lipoxygenase (LOX) изозимы могут генерировать продукты, которые могут увеличить или уменьшить нейровоспламенение и нейродегенерации. Исследование взаимодействия генно-экологической среды может выявить эффекты, связанные с LOX isozyme. Использование 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (MPTP) модель нигостриатального повреждения в двух ЛОКС изозим-дефицит трансгенных линий позволяет сравнить вклад ЛОКС изозимов на дофаминергической целостности и воспаления.
Общая цель следующего эксперимента заключается в изучении роли изоферментов липоксигеназы в нигростриальной дегенерации, связанной с болезнью Паркинсона. Для этого тщательно подготавливается нейротоксин, вызывающий поражение черного вещества и стриатума (Nigro SAL). Затем мышам с дефицитом Lox ежедневно вводят раствор MPTP в течение четырех дней подряд; анализ проводится через семь дней после последней инъекции.
Образцы собирают и используют для биохимического или иммуногистологического анализа. Результаты показывают, что 1215 locks не влияет на нигростриарную токсичность MPTP. Однако five locks способствует повреждению в условиях токсичности.
Метод TS может помочь ответить на ключевые вопросы в области изучения болезни Паркинсона. Предложите вариант того, как взаимодействия между генами и окружающей средой влияют на уязвимость nistri. Используя модели взаимодействия генов и среды, мы смогли определить селективные функции ISO и получить представление о дуализме пяти липидов.
На протяжении всей описанной процедуры надлежащим образом обученный персонал должен использовать соответствующие средства индивидуальной защиты. Начните с выполнения всех необходимых расчетов для приготовления раствора нейротоксина. Затем подготовьте все требуемое оборудование, расходные материалы и реагенты.
Кроме того, подготовьте материалы для ликвидации возможных разливов. Покройте область вокруг весов салфетками или бумажными полотенцами. В качестве меры предосторожности держите рядом салфетки и 10% раствор гипохлорита натрия, смоченные в этом растворе, чтобы снизить риск при рассыпании порошка.
Когда будете готовы, извлеките исходный флакон из соответствующего места хранения. На стеклянном флаконе с MPTP укажите концентрацию и дату. Используя аналитические весы, расположенные в вытяжном шкафу, навесьте 50 milligrams MPTP в стеклянный флакон с вторичной защитной оболочкой, содержащей салфетку, пропитанную 10%bleach.
Затем закройте флакон-исходник и медленно протрите его внешнюю поверхность 10% раствором гипохлорита натрия. Добавьте во флакон 13,763 milliliters стерильного физиологического раствора и закройте его перед тщательным перемешиванием в вытяжном шкафу. Осторожно профильтруйте и стерилизуйте раствор MPTP, перенеся его в маркированный флакон для инъекций, помещенный во вторичный контейнер с салфеткой, смоченной в 10% растворе гипохлорита натрия.
Чтобы снизить давление, слегка ослабьте крышку флакона с отфильтрованным раствором MPTP. Удалите любые пролитые капли салфеткой, смоченной в отбеливателе; использованные материалы утилизируйте в соответствующим образом маркированный контейнер для биоопасных отходов. Для транспортировки в помещение для проведения процедур с животными держите флакон с раствором MPTP во вторичном контейнере вместе с салфеткой, смоченной в отбеливателе.
Поместите флакон с MPTP во вторичный контейнер и верните его в соответствующее место хранения. В завершение проведите деконтаминацию шпателя, аналитических весов и поверхности вытяжного шкафа в течение 10 минут, используя 10% раствор гипохлорита натрия.
Перед введением препаратов животным подготовьте одноразовые клетки с перфорированными крышками-фильтрами. Пометьте их как MPTP. Вставьте одноразовые подстилки, предварительно увлажненные гранулы корма и гидрогель в качестве источника воды.
Затем взвесьте всех животных и рассчитайте объем раствора MPTP, необходимый для инъекции в дозе 15 mg/kg. После подготовки с особой осторожностью зафиксируйте мышь над одноразовой абсорбирующей салфеткой и введите раствор MPTP. Повторяйте эту процедуру ежедневно в течение четырех дней; не надевайте колпачок на иглу, а помещайте ее в специальный маркированный контейнер для биоопасных острых отходов MPTP.
Держите под рукой 10%-й раствор отбеливателя и салфетки. Для очистки случайных капель поместите животных, которым ввели MPTP, в заранее подготовленные одноразовые клетки и разместите их на открытых стеллажах. Затем переходите к этапу после введения MPTP.
Разместите предупреждающие таблички на стойке и на двери помещения для содержания животных до истечения 72 часов после последней инъекции. Продезинфицируйте рабочую поверхность раствором гипохлорита натрия. После каждой процедуры утилизируйте остатки раствора MPTP, добавив эквивалентный объем 10% раствора гипохлорита натрия.
Для утилизации биоопасных жидких отходов поместите все использованные СИЗ в специальные контейнеры для утилизации, при необходимости предварительно обработав их 10% раствором гипохлорита натрия. В ходе данной процедуры важно регулярно проверять состояние животных и ежедневно обновлять корм и воду. Через три дня после последней инъекции утилизируйте все материалы и верните животных в обычные условия содержания.
В заранее установленные временные точки эксперимента извлекали животных для забора и обработки тканей. Для измерения уровней дофамина у мышей дикого типа и мышей с нокаутом five locks, получавших либо физиологический раствор, либо MPTP, использовались гомогенаты Stri AAL. В группах, получавших физиологический раствор, наблюдалось влияние генотипа на уровни DA: у трансгенных мышей уровни DA были ниже. Однако после введения MPTP мыши с дефицитом five locks были защищены от истощения SAL DA.
У мышей с нокаутом пяти замков в группе MPTP наблюдались уровни DA, сходные с показателями мышей с нокаутом пяти замков в группе физиологического раствора. Напротив, у мышей с нокаутом 1215 замков генотип не влиял на уровни дофамина независимо от группы терапии. Иммунофлуоресцентное окрашивание на TH и GFAP в компактном отделе черной субстанции выявило меньшее количество TH-положительных тел клеток, отмеченных звездочкой, и усиленную иммунореактивность GFAP в группе дикого типа, подвергнутой воздействию MPTP. Окрашивание микроглии методом DAB показало разветвленные тела клеток и длинные ветвящиеся отростки у мышей, получавших физиологический раствор, в то время как у мышей, получавших MPTP, наблюдалась активированная микроглия с округлыми телами клеток и короткими утолщенными отростками. Иммуноблоттинг на SAL, TH и GFAP предоставил дополнительные доказательства повреждений и нейровоспаления, возникших в результате воздействия MPTP.
Эти эффекты были ослаблены у мышей с дефицитом five locks isy. Поскольку работа с MPTP может быть чрезвычайно опасной, при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование средств индивидуальной защиты и наличие 10% раствора bridge под рукой для нейтрализации соединения.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании изучается роль изоферментов липоксигеназы (LOX) в нигростриарной дегенерации, связанной с болезнью Паркинсона. С использованием модели с применением нейротоксина оценивается влияние дефицита LOX на целостность дофаминергических нейронов и воспаление.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Нейровоспаление
- Нейродегенерация
Теоретическое обоснование
- Изозимы липоксигеназы могут влиять на нейровоспаление и нейродегенерацию.
- Взаимодействия между генами и окружающей средой могут выявить эффекты, специфичные для конкретных изозимов LOX.
- Модель MPTP используется для изучения повреждения нигростриальных путей.
- Понимание роли LOX может дать представление о механизмах болезни Паркинсона.
Цель исследования
- Изучить вклад изоформ LOX в поддержание целостности дофаминергической системы.
- Оценить влияние дефицита LOX на повреждения, индуцированные нейротоксинами.
- Выявить специфические эффекты изоформ LOX при нейровоспалении.
Используемые методы
- Приготовление нейротоксина для индукции нигростриарных повреждений.
- Инъекция раствора MPTP мышам с дефицитом LOX.
- Сбор образцов для биохимического и иммуногистологического анализа.
- Сравнение результатов между различными линиями с дефицитом изозимов LOX.
Основные результаты
- 1215 LOX не влияет на токсичность MPTP в нигростриарном пути.
- Five LOX способствует нейротоксическому повреждению при определенных условиях.
- Результаты указывают на различную роль изоформ LOX в нейродегенерации.
- Полученные данные могут лечь в основу терапевтических стратегий лечения болезни Паркинсона.
Выводы
- Изозимы LOX оказывают различное воздействие на нейровоспаление и дегенерацию.
- Понимание этих функций может привести к разработке методов таргетного вмешательства.
- Необходимы дальнейшие исследования для изучения механизмов действия изозимов LOX.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Модели взаимодействия генов и окружающей среды позволяют проводить механизмный анализ рисков терапевтических мишеней при нейродегенеративных заболеваниях, выявляя специфический вклад определенных изоформ в токсичность, который остается скрытым в чисто генетических моделях или моделях воздействия токсикантов. Такой подход способствует валидации мишеней и повышению прогностической уверенности на ранних этапах поиска, уточняя значимость сигнальных путей и снижая количество ложноположительных результатов при идентификации перспективных соединений. Использование общепринятых моделей нейротоксинов, таких как MPTP, обеспечивает трансляционную преемственность при оценке дофаминергической нейродегенерации и нейровоспалительных реакций в исследованиях болезни Паркинсона.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Проверка терапевтической гипотезы путем определения того, модулируют ли специфические изозимы LOX нигростриарную дегенерацию в контексте взаимодействия генов и окружающей среды.
- Операционная ценность: Обеспечение функциональной валидации мишени с помощью моделей с селективным нокаутом изоформ при воздействии соответствующего нейротоксина.
- Прогностическая ценность: Поддержка приоритизации портфеля исследований путем выявления изоформ LOX, которые способствуют повреждению дофаминергических нейронов в условиях окислительного стресса и воспаления.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем (мышей с дефицитом LOX) для последующей стандартизации анализов и скрининга соединений в путях нейродегенерации.
- Практическая ценность: Получение полуколичественных данных вестерн-блоттинга и ВЭЖХ (метаболиты дофамина, TH, GFAP), что позволяет проводить воспроизводимую количественную оценку степени тяжести поражения.
- Ценность масштабируемости: Возможность повторного использования платформы для различных моделей нейротоксинов и генотипов для согласованной оценки взаимодействия с мишенью и модуляции сигнальных путей.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Сохраняет релевантность модели заболевания за счет использования MPTP для воспроизведения нигростриарных повреждений и нейровоспаления, наблюдаемых при болезни Паркинсона.
- Операционная ценность: Позволяет принимать обоснованные с учетом рисков решения о дальнейшем продвижении исследований, связывая активность изоформ LOX с целостностью дофаминергической системы и активацией глии в черной субстанции и стриатуме.
- Трансляционная преемственность: Обеспечивает связь между валидацией мишени на этапе поиска и доклинической оценкой посредством стандартизированных показателей нейродегенерации и воспаления.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в континуум открытий — от проверки гипотез о мишенях через идентификацию ведущих соединений до доклинической валидации, — обеспечивая понимание механизмов взаимодействия генов и окружающей среды, которые влияют на выживаемость дофаминергических нейронов.
- Открывательная биология: Поддерживает проверку гипотез и уточнение путей передачи сигналов, выявляя вклад конкретных изоформ LOX в токсичность, индуцированную MPTP.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированного воздействия нейротоксина и количественных биохимических показателей (определение уровня дофамина методом ВЭЖХ, анализ TH методом вестерн-блоттинга), которые позволяют проводить надежную оценку соединений.
- Аналитика: Генерирует измеряемые результаты (уровни дофамина, экспрессия TH, иммунореактивность GFAP/Iba-1), позволяющие сравнивать нейротоксический эффект для различных генотипов и условий лечения.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями благодаря установленной модели MPTP и нейровоспалительным биомаркерам, значимым для патогенеза болезни Паркинсона.
- Корпоративное повторное использование: Создает воспроизводимую методику оценки модуляции мишеней в путях нейродегенерации для различных изоформ LOX и парадигм воздействия нейротоксинов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность за счет устранения неопределенности в механизмах участия изоформ LOX в нейродегенерации.
- Операционная ценность: Повышает стандартизацию и воспроизводимость благодаря определенному дозированию MPTP, контролю генотипа и мультимодальным биохимическим/гистологическим показателям.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработок (go/no-go) путем определения мишеней (например, 5-LOX), модулирующих токсичность, что снижает биологические риски на поздних стадиях программ по нейродегенеративным заболеваниям.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию с учетом рисков, позволяя отличить ключевые факторы (5-LOX) от факторов, не оказывающих влияния (12/15-LOX), в моделях поражения дофаминергических нейронов.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с нейротоксинами, генотипированием мышей и биохимическим анализом дофаминергических путей.
- Зависимость от аналитического оборудования для количественного определения метаболитов дофамина методом ВЭЖХ и вестерн-блоттинга для детекции TH, GFAP и Iba-1.
- Необходима межкомандная стандартизация между группами фармакологии in vivo, гистологии и биохимии для обеспечения согласованного количественного анализа повреждений.
- Требуется учет особенностей адаптации при расширении исследования на другие модели нейротоксичности или нейродегенеративные фенотипы, помимо повреждений нигростриарного пути, индуцированных MPTP.
- Включает практические ограничения, такие как необходимость строгого соблюдения протоколов безопасности при работе с нейротоксинами, а также вариативность чувствительности к MPTP в зависимости от линий мышей и условий содержания.
