Высокая пропускная Флуорометрический Измерение Потенциал почвы внеклеточных активности ферментов
15 ноября 2013 г.
Для измерения потенциальные темпы почвенных внеклеточных деятельности ферментных, синтетические субстраты, которые связаны с флуоресцентным красителем добавляются в образцах почвы. Активность фермента измеряется как флуоресцентный краситель высвобождается из субстрата фермента катализируемой реакции, где выше флуоресценции указывает на более деградации субстрата.
Общая цель данной процедуры заключается в количественном определении максимально потенциальных скоростей, с которыми внеклеточные ферменты в почвах разлагают свои целевые субстраты. Это достигается путем предварительного смешивания полевой влажной почвы и буфера в блендере с последующим переносом смешанных образцов пипеткой в планшет для образцов с глубокими лунками и планшеты со стандартами с глубокими лунками. Планшеты с глубокими лунками инкубируют и центрифугируют, после чего 250 µL переносят из каждой лунки планшетов с глубокими лунками в соответствующие лунки черного планшета с плоским дном.
96-луночные планшеты. Затем три планшета считывают на флуориметре, и полученные данные анализируют. В конечном итоге потенциальная активность внеклеточных ферментов почвы определяется скоростью высвобождения флуоресцентного красителя из субстрата в результате ферментативной реакции, при которой более высокая флуоресценция указывает на более интенсивную деградацию субстрата.
Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими является возможность измерять активность ферментов в большом количестве образцов благодаря использованию глубоких 96-луночных микропланшетов. Идея этого метода возникла у нас, когда мы увидели возможность увеличить объем образца по сравнению со стандартным микропланшетом путем адаптации других протоколов к формату глубоколуночных планшетов. Применение этой методики позволяет нам более эффективно связывать физиологию микроорганизмов с процессами экосистемного масштаба.
Визуальная демонстрация имеет решающее значение для данной методики, поскольку она содержит множество нюансов и особенностей работы с образцами, которые трудно передать в письменном описании. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в областях микробной экологии и почвенной биогеохимии, например, о том, как почвенные микроорганизмы реагируют на изменения в окружающей среде и как их физиологические реакции влияют на важнейшие экосистемные процессы, такие как разложение и круговорот питательных веществ. Хотя данный метод позволяет получить представление о разложении органического вещества почвы, круговороте питательных веществ и наземных экосистемах, он также может быть применен к морским и пресноводным системам.
Как правило, лица, впервые использующие данный метод, могут столкнуться с трудностями при работе с пипетками, а также с проблемами, связанными с временными ограничениями данного протокола. Кроме того, большой объем данных, получаемых в ходе этой процедуры, иногда может оказаться чрезмерным для начинающих пользователей. Для начала подготовки анализа промаркируйте три глубокодонные планшеты как «стандарт MUB для 4-метилбензоксазолона» и «стандарт MUC для 7-амино-4-метилкумарина».
Налейте каждый стандарт и субстрат в отдельные чистые предварительно промаркированные резервуары, расположенные рядами. Затем перенесите с помощью пипетки соответствующий стандарт MUB в соответствующие лунки планшета для стандартов MUB, как указано в текстовом протоколе. Повторите этот процесс для стандартов MUC, перенося их в соответствующие лунки планшета для стандартов MUC для подготовки почвенных суспензий.
Для каждого образца почвы взвесьте 2,75 грамма полевой влажной почвы перед добавлением в блендер. Добавьте 91 миллилитр 50 миллимолярного буфера и перемешивайте на высокой скорости в течение одной минуты. Перелейте содержимое блендера в чистую стеклянную чашу с магнитным перемешивателем, ширина которой не меньше ширины восьмиканального дозатора.
Почвенную суспензию можно процедить через сито с диаметром отверстий около одного миллиметра перед переливанием в чашу. Поместите чашу на перемешивающую пластину и перемешайте почвенную суспензию. Затем перенесите 800 µL почвенной суспензии в первую колонку планшета с образцами.
Повторите те же действия для первого столбца стандартных планшетов MUB и MUC. Между обработкой образцов почвы промывайте блендер, магнитную мешалку и магнитный якорь деионизированной водой или буфером. Повторяйте этот процесс для каждого образца почвы.
Переходите к следующей колонке с каждым последующим образцом. Затем перенесите пипеткой соответствующий субстрат в соответствующие лунки планшета с образцами. Как указано в текстовом протоколе, подготовьте отдельный планшет с образцами для каждой тестируемой температуры инкубации.
Герметизируйте глубокодонные планшеты с помощью специальных матов. Переворачивайте каждую запечатанную планшету вручную до полного перемешивания раствора. Поместите планшеты в соответствующий инкубатор на время инкубации, указанное в текстовом протоколе; зафиксируйте начальное время как нулевую точку, а также соответствующее время инкубации по окончании каждого периода инкубации.
Центрифугируйте герметично закрытые планшеты в течение трех минут при ускорении примерно 2 900 G. После центрифугирования перенесите 250 µL из каждой лунки инкубированных глубоких планшетов в соответствующие лунки черных плоскопадонных 96-луночных планшетов. Для каждого инкубированного глубокого планшета используйте одну черную планшету.
Важно перенести образцы из инкубированных планшетов с глубокими лунками в соответствующие лунки черных плоских 96-луночных планшетов согласно инструкциям производителя используемого флуориметрического планшетного ридера. Установите длину волны возбуждения на 365 нанометров, а длину волны эмиссии — на 450 нанометров.
Загрузите один из стандартных планшетов, установите в флуориметре автоматический режим усиления и считайте данные с планшета. Затем переключите усиление в ручной режим и уменьшите значение от оптимального до следующего ближайшего меньшего числа, кратного пяти. Для каждого стандартного планшета повторите измерение дважды.
Затем загрузите планшет с образцами. Установите усиление в автоматический режим и запустите анализ планшета с образцами. Повторно проанализируйте планшет с образцами вручную, чтобы подобрать максимальное усиление для каждого из стандартных планшетов.
Начните анализ данных с ввода показателей флуоресценции стандартной кривой для стандартов MUB и MUC в электронную таблицу. Переведите микромолярные концентрации в микромоли для каждого образца. На основе данных флуоресценции стандартной кривой рассчитайте наклон, точку пересечения с осью y и значения R-квадрат для концентраций стандартов MUB и MUC.
Приемлемые значения r² для каждого образца должны превышать 0,98. Стандартные кривые можно визуализировать в виде диаграммы рассеяния, где показатели флуоресценции отложены по оси зависимой переменной, а стандартная концентрация — по оси независимой переменной. Внесите необработанные данные флуоресценции образца с субстратом в новую электронную таблицу.
Также укажите время инкубации и сухую массу почвы для каждого образца, вычтите значения пересечения стандартной кривой из соответствующих значений флуоресценции образцов, а затем разделите полученный результат на наклон соответствующей стандартной кривой. Используя уравнение стандартной прямой, умножьте количество микромолей в образце на 91 milliliters, что соответствует объему буфера, использованного в почвенной суспензии. Разделите полученное значение на время инкубации конкретного образца и сухую массу почвы.
Наконец, умножьте полученное значение на 1000, чтобы привести его к нужным единицам измерения. Результаты представлены на основе экспериментального климатического исследования, в котором сравнивались почвы, находившиеся в условиях естественного климата, с почвами, подвергшимися воздействию повышенной концентрации диоксида углерода и нагреву; здесь показана потенциальная активность внеклеточных ферментов (EEA) на участке прерий с нагревом и обогащением повышенным содержанием диоксида углерода в контрольных и опытных вариантах. В данном примере потенциальная активность ферментов, обеспечивающая усвоение углерода, азота и фосфора, измеренная на глубине почвы от 0 до 5 см, не имела значимых различий в зависимости от варианта экспериментального воздействия.
Однако на глубине почвы от 5 до 15 см несколько потенциальных ЭФФ значительно различались. Например, активность углерод-деградирующих ферментов бета-1,4-глюкозидазы и бета-D-целлобиогидролазы была ниже на участках с повышенным содержанием диоксида углерода и воздействием нагрева по сравнению с участками с фоновыми климатическими условиями. Активность ферментов, минерализующих азот и фосфор, также была ниже на опытных участках по сравнению с участками с фоновыми климатическими условиями на глубине почвы от 5 до 15 см.
Расчет и построение графика суммы всех потенциальных ЭЭА циклов углерода, азота или фосфора может быть полезным подходом для наблюдения более широких закономерностей в отношении потенциальных циклов углерода, азота и/или фосфора в почве. В данном примере сумма потенциальных ЭЭА β-1,4-глюкобета-D-целлобиогидролазы, β-ксилозидазы и α-1,4-глюкозидазы была рассчитана для представления потенциальной активности цикла углерода. Сумма потенциальных ЭЭА β-1,4-N-ацетилглюкозанилидазы и L-лейциламинопептидазы была рассчитана для представления потенциальной активности цикла азота.
Для представления потенциальной активности цикла фосфора использовалась фосфатаза. Потенциальные EEA для циклов общего углерода, азота и фосфора имели тенденцию к снижению на участках с повышенным содержанием диоксида углерода и нагревом по сравнению с участками с фоновыми климатическими условиями на глубине почвы от 5 до 15 см. Однако эта тенденция была значимой только для активности циклов общего азота и фосфора, а значения EEA почвы существенно не различались между опытными участками.
На глубине почвы от 0 до 5 см. Результаты указывают на противоположные тенденции в активности ферментов и функциональных групп между опытными участками в зависимости от глубины почвы; соотношение потенциальных ЭЭА является одним из способов оценки потребностей микробов в питательных веществах. В данном случае активность почвенных ферментов, геометрия пор, соотношение углерода к азоту, углерода к фосфору или азота к фосфору значимо различаются между опытными участками на глубине почвы от 0 до 5 см.
Тем не менее, потенциальные соотношения углерода к фосфору и азота к фосфору для ферментов были выше на участках с повышенным содержанием диоксида углерода и воздействием нагрева. По сравнению с условиями окружающей среды на глубине почвы от 5 до 15 см температура может оказывать сильное влияние на почвенные EEAs. Однако в типичных лабораторных анализах активность почвенных ферментов измеряется при одной температуре, которая может не соответствовать температурным условиям in C two.
Графики Аррениуса используются для визуализации энергии активации; на оси x откладывается логарифм активности фермента как функция обратной температуры, переведенной в градусы Кельвина. Энергия активации обычно определяется как минимальная энергия, необходимая для катализа химической реакции, и используется здесь в качестве показателя температурной чувствительности реакций, катализируемых ферментами. Более высокая энергия активации указывает на более высокую температурную чувствительность фермента.
Аналогичным образом, энергия активации напрямую соответствует Q 10. Были оценены значения температурного коэффициента потенциальной кинетики ферментов для внеклеточной активности (EEA) углерода, азота и фосфора на обоих опытных участках на двух глубинах почвы; результаты показали, что температурная чувствительность EEA существенно не различалась между опытными участками ни на одной из глубин почвы. После освоения метода инокуляцию 12 образцов в 96-луночные микротитрационные планшеты можно выполнить за 30 минут или быстрее.
Кроме того, по истечении установленного времени инкубации обычно можно повторно центрифугировать, переносить и считывать планшеты на урометре в течение получаса. При выполнении этой процедуры важно соблюдать единообразие при дозировании. Наличие пузырьков воздуха при пипетировании отрицательно скажется на результатах после выполнения данной процедуры.
Для получения дополнительных ответов на вопросы, касающиеся роли состава почвенного микробного сообщества в функционировании почвы после её формирования, могут быть применены другие методы, такие как экстракция и секвенирование ДНК. Данная методика открыла исследователям в области микробной экологии путь к изучению круговорота питательных веществ и биогеохимических процессов в наземных экосистемах. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как количественно определить потенциальную ферментативную активность.
Кроме того, вы должны уметь интерпретировать данные для анализа потенциальных микробных реакций на такие факторы, как климат и различные типы почв в разных экосистемах. Не забывайте, что при работе с флуоресцентными материалами следует всегда принимать меры для минимизации воздействия света из-за светочувствительности флуорофора.
Обзор
В данной статье представлен метод количественного определения потенциальной активности внеклеточных ферментов почвы с использованием флуоресцентных субстратов. Этот метод позволяет эффективно измерять активность ферментов в большом количестве образцов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробная экология
- Биогеохимия почв
Теоретическое введение
- Внеклеточные ферменты играют важнейшую роль в круговороте питательных веществ в почве.
- Понимание активности ферментов позволяет связать физиологию микроорганизмов с экосистемными процессами.
- Существующие методы могут быть недостаточно эффективны при работе с большими объемами образцов.
Цель исследования
- Разработка метода измерения активности почвенных ферментов в высокопроизводительном формате.
- Изучение реакции почвенных микроорганизмов на изменения окружающей среды.
- Оценка последствий для таких экосистемных процессов, как разложение.
Используемые методы
- Приготовление почвенных суспензий и стандартов в глубоких планшетах с лунками.
- Инкубация и центрифугирование образцов.
- Флуориметрический анализ для измерения активности ферментов на основе высвобождения флуоресцентного красителя.
- Анализ данных с использованием стандартных кривых для количественного определения.
Основные результаты
- Данный метод позволяет проводить одновременный анализ нескольких образцов.
- Более высокая флуоресценция указывает на более интенсивную деградацию субстрата.
- Стандартные кривые обеспечивают надежное количественное определение активности ферментов.
Выводы
- Данный метод позволяет углубить понимание микробиологических процессов в почвах.
- Он может быть адаптирован для использования в морских и пресноводных системах.
- Визуальные демонстрации необходимы для эффективного внедрения данного метода.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Этот высокопроизводительный флуорометрический анализ позволяет быстро количественно определить потенциальную активность внеклеточных ферментов в образцах почвы, что способствует механистическому снижению рисков при валидации мишеней в рамках разработки агрохимических препаратов и экологических биотехнологий. Путем измерения деградации субстрата в нелимитирующих условиях данный метод обеспечивает прогностическую достоверность микробных функциональных ответов на стрессовые факторы окружающей среды, что позволяет принимать обоснованные решения на ранних этапах поиска в исследованиях по устойчивому сельскому хозяйству и биоремедиации.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет исследовать микробные метаболические пути путем количественного определения активности ферментов циклов углерода, азота и фосфора в качестве функциональных показателей физиологии микроорганизмов.
- Практическая ценность: Обеспечивает возможность высокопроизводительного скрининга образцов окружающей среды для проверки гипотез, касающихся механизмов получения питательных веществ и реакции на стресс.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка стандартизированных почвенных суспензий в глубоких планшетах позволяет минимизировать диффузионные ограничения и обеспечить воспроизводимость взаимодействий между ферментом и субстратом для больших наборов образцов.
- Практическая ценность: Использование формата глубоких 96-луночных планшетов обеспечивает масштабируемую параллельную обработку до 12 образцов менее чем за 30 минут, что способствует стандартизации анализа и повышению эффективности рабочего процесса.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Связывает активность микробных ферментов с процессами экосистемного масштаба, такими как разложение и круговорот питательных веществ, предоставляя систему моделирования патологий, релевантную для оценки рисков для здоровья окружающей среды.
- Практическая ценность: Обеспечивает возможность сравнения данных из разных локаций при условии нормировки по сухому весу почвы, времени инкубации и объему буфера, что позволяет обеспечить трансляционную преемственность от лабораторных измерений к функциональным прогнозам, релевантным для полевых условий.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего поиска, обеспечивая количественные результаты на основе флуоресценции, которые позволяют проверять гипотезы, уточнять метаболические пути и снижать биологические риски до этапа идентификации ведущих соединений в программах по экологической биотехнологии.
- Открывающая биология: Поддерживает проверку гипотез о функциональных реакциях микробов на изменения окружающей среды посредством количественного измерения потенциальной активности ферментов как показателей метаболической способности.
- Скрининг: Обеспечивает готовность и воспроизводимость анализа за счет стандартизированного приготовления почвенной суспензии и инкубации в планшетах с глубокими лунками, что минимизирует техническую вариабельность при использовании высокопроизводительных форматов.
- Аналитика: Позволяет получать количественные измерения зависимой переменной (интенсивность флуоресценции во времени), что дает возможность рассчитывать скорость ферментативной активности с помощью стандартных кривых, обеспечивая сравнение условий на основе данных.
- Трансляционные исследования: Связывает лабораторные измерения потенциальной активности ферментов с доклинической преемственностью путем моделирования тенденций круговорота питательных веществ в условиях повышенного содержания CO2 и температуры.
- Корпоративное повторное использование: Создает возможность повторного использования метода для скрининга функциональных реакций микробов в различных типах почв и условиях окружающей среды, сокращая необходимость в избыточной разработке методов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Обеспечивает прогностическую уверенность при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности в путях круговорота питательных веществ микроорганизмов в контролируемых лабораторных условиях.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость благодаря использованию глубоколуночных планшетов, буферизированных почвенных суспензий и флуориметрического считывания с нормализацией усиления.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений «go/no-go» на ранних этапах поиска, позволяя осуществлять приоритизацию микробных мишеней с поправкой на риск на основе профилей функциональной активности в условиях стресса.
- Влияние на портфель: Поддерживает обоснованные с учетом рисков решения о дальнейшем продвижении за счет количественной оценки тенденций в циклах углерода, азота и фосфора как индикаторов функциональной устойчивости экосистемы.
Особенности реализации
- Требуются навыки в области методов микробной экологии, приготовления почвенных суспензий и анализа флуориметрических данных.
- Необходим доступ к глубоким планшетам, планшетным ридерам с регулируемым усилением сигнала и центрифугам, способным развивать ускорение 2,900 G.
- Требуется межгрупповая стандартизация измерения сухого веса почвы, времени инкубации и правил работы с субстратом для обеспечения сопоставимости данных.
- При распространении метода на морские или пресноводные системы необходимо учитывать адаптацию в связи с различиями в ионной силе и естественных значениях pH.
- Практические ограничения включают чувствительность к нестабильности флуоресцентных соединений и возможные помехи со стороны почвенных примесей, что требует осторожного обращения с субстратом и защиты от света.
