Submillisecond конформационные изменения в белках решены фототермического отклонения луча

Общая цель следующего эксперимента заключается в характеристике конформационных изменений, связанных с связыванием лиганда с transducers кальция в субмиллисекундном временном масштабе. Конформационный переход от APO-белка к белку, связанному с кальцием, инициируется фотолизом «заклеточного» соединения кальция calcium DM nitro, что приводит к фотовысвобождению свободного кальция. Сопутствующее изменение показателя отражения измеряется как смещение зондирующего луча с помощью четырехпозиционного чувствительного детектора.

Затем измеряют кривые отклонения фототермического пучка в зависимости от температуры как для образца, так и для эталона. Совместный анализ кривых отклонения фотопучка позволяет понять механизм конформационного переключения, индуцированного кальцием, с точки зрения изменения объема реакции и энтальпии. Основным преимуществом метода отклонения фототермического пучка по сравнению с существующими методами, такими как top flow, является то, что данная методика позволяет одновременно регистрировать изменения объема и энтропии в субмиллисекундном временном масштабе.

Визуальная демонстрация этой методики необходима, так как точное выравнивание прибора имеет решающее значение для восстановления термодинамических параметров. Процедуру продемонстрирует Уолтер Гонзалес, аспирант моей лаборатории. Подготовку образца и все манипуляции с ним следует проводить в темной комнате, чтобы предотвратить любое нежелательное высвобождение из клеток. В данном видео этапы демонстрируются при освещении в целях съемки.

Для начала растворите DM Nitro в 50 мМ HEPES-буфере с 100 мМ хлоридом калия (pH 7,0) до конечной концентрации 400 µM. Добавьте хлорид кальция из 0,1 M стокового раствора для достижения необходимого соотношения концентраций кальция и DN nitro. Затем растворите эталонное соединение, цианид калия или хромат натрия, в том же буфере.

Что касается образца, обратитесь к текстовому протоколу для ознакомления со схемой базовой экспериментальной конфигурации фототермического отклонения луча. При подготовке эксперимента направьте пробный луч через центр кюветы, помещенной в держатель с контролем температуры. Затем с помощью диафрагмы-пинхола отрегулируйте диаметр пробного луча до 1 мм, и используйте второе зеркало за образцом, чтобы центрировать пробный луч относительно центра позиционно-чувствительного детектора.

Сфокусируйте пробный пучок в центре детектора таким образом, чтобы разница напряжений между двумя верхними и двумя нижними диодами, а также разница напряжений между двумя диодами по левой и правой сторонам детектора была равна нулю. Затем сформируйте диаметр пучка накачки — излучения лазера ND YAG с длиной волны 355 nm. Используя диафрагму с отверстием 3 mm, расположенную между двумя зеркалами для лазера 355 nm, направьте пучок накачки соосно через центр ячейки.

Важно, чтобы оба лазерных луча распространялись через центр оптической кюветы практически коллинеарно. Чтобы получить измеримый угол отклонения и, следовательно, высокую амплитуду фототермического отклонения луча или сигнала PBD, используйте эталонное соединение для юстировки зондирующего и возбуждающего лучей до достижения удовлетворительного сигнала PBD, характеризующегося хорошим соотношением сигнал/шум и стабильной амплитудой PBD на длительных временных интервалах. Затем установите положение возбуждающего луча относительно зондирующего путем постепенной регулировки зеркал лазера с длиной волны 355 nanometer.

Измерьте амплитуду опорного сигнала PBD как разность между сигналами верхнего и нижнего фотодиодов позиционно-чувствительного детектора. Сигнал PBD должен демонстрировать быстрый рост амплитуды на коротком временном интервале и оставаться стабильным в масштабе 100 миллисекунд. Проверьте линейность амплитуды сигнала PBD относительно выделившейся тепловой энергии, измерив линейную зависимость сигнала PBD от мощности возбуждающего лазера и от количества поглощенных эйнштейнов.

Поддерживайте мощность лазера на уровне ниже примерно 1000 µJ, чтобы предотвратить многофотонное поглощение. Также следите за тем, чтобы абсорбция образца или эталонного соединения на длине волны возбуждения составляла менее 0,5, чтобы избежать снижения мощности накачки. Эти меры обеспечат линейность сигнала PBD.

Начните с измерения следов PBD. Для контроля поместите раствор эталонного соединения в кварцевую кювету и установите кювету в держатель с контролируемой температурой. Зарегистрируйте эталонный сигнал PBD в зависимости от температуры в диапазоне от 16 до 35 градусов Цельсия с шагом в три градуса Цельсия.

После каждого изменения температуры проверяйте положение зондирующего пучка на позиционно-чувствительном детекторе и при необходимости заново центрируйте его. Если потребуется, проверьте линейность сигнала PBD, как описано в текстовом протоколе.

Затем поместите раствор образца в ту же оптическую кювету, которая использовалась для стандартного соединения, соблюдая ту же ориентацию кюветы, что и при измерении стандарта. Перейдите к детектированию следов PBD образца в том же температурном диапазоне, что и для стандарта, и проверьте линейность амплитуды PBD образца. Рассчитайте амплитуду эталонного сигнала PBD как разность между сигналами PBD до и после триггера.

Аналогичным образом определите амплитуду быстрой и медленной фаз сигнала PBD образца. Чтобы исключить параметр инструментального отклика, нормируйте амплитуду сигнала PBD образца по амплитуде эталонного сигнала PBD. Для эталона отношение сигнала образца к эталонному сигналу позволяет получить уравнение, из которого по наклону и точке пересечения графика зависимости произведения отношения амплитуд на энергию от температурного члена можно определить тепловыделение в раствор и нетепловое изменение объема, связанное с фотоинициированной реакцией; чтобы определить объем реакции и изменение энтальпии для быстрой и медленной фаз, нормируйте наблюдаемые изменения объема и энтальпии на соответствующий квантовый выход.

Согласно уравнениям, приведенным в текстовом протоколе, амплитуды и времена жизни отдельных стадий анализируют путем аппроксимации данных функцией от времени, описывающей изменения объема и энтальпии. Амплитуда быстрой стадии соответствует амплитуде мгновенной фазы сигнала PBD образца, а амплитуда последующей стадии — амплитуде медленной фазы сигнала PBD образца. Для каждого отдельного процесса параметры энтальпии и энтропии активации могут быть легко определены с помощью графиков IR на основании температурной зависимости константы скорости этих процессов.

Здесь представлен типичный пример графиков PBD для фотовысвобождения кальция из calcium DM nitro. Быстрая фаза соответствует фоторасщеплению calcium DM nitro и высвобождению кальция, тогда как медленная фаза отражает связывание кальция с не подвергнутой фотолизу клеткой. Здесь показан график PBD для ассоциации кальция с С-концевым доменом нейронального кальциевого сенсора DREAMS (downstream regulatory element antagonist, regulator, or dream) при фотодиссоциации кальция.

Высвобожденный фотолигандом лиганд связывается с С-концевым доменом dream с постоянной времени 1,3 ± 0,3 мс при 20 °C, что определено по температурной зависимости наблюдаемой константы скорости. Энергетический барьер активации связывания кальция с С-концевым доменом dream составил 9,2 ± 0,4 ккал/моль. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости измерения трасс PBD образца в условиях, идентичных условиям для референса.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как подготовить образец, настроить оборудование и проанализировать данные для получения воспроизводимого термодинамического параметра.