Submillisecond конформационные изменения в белках решены фототермического отклонения луча

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы охарактеризовать подтверждающие изменения, связанные со связыванием лиганда с кальциевыми преобразователями в масштабе менее миллисекунды. Подтверждающий переход между белком APO и связанным с кальцием белком вызывается фоторасщеплением соединения кальция в клетке нитро кальция DM, что приводит к фотовысвобождению свободного кальция. Связанное с этим изменение индекса отражения измеряется как смещение пучка зонда с помощью четырехпозиционного чувствительного детектора.

Затем измеряются кривые отклонения фототермического луча в зависимости от температуры как для образца, так и для эталона. Комплексный анализ следов отклонения фотолуча дает представление о механизме индуцированного кальцием подтверждающего переключения с точки зрения объема реакции и изменений энтальпии. Основное преимущество отклонения фототермического луча от существующей мачты, такого как верхний поток, заключается в том, что этот метод позволяет одновременно обнаруживать изменения объема и энтропии в масштабе менее миллисекунды.

Визуальная демонстрация этого метода необходима, так как точное выравнивание прибора имеет решающее значение для восстановления термодинамических параметров. Уолтер Гонсалес, аспирант из моей лаборатории, будет демонстрировать эту процедуру: «Проведите подготовку образцов и все манипуляции с образцами в темной комнате, чтобы предотвратить любое нежелательное освобождение от клеток». В этом видео шаги демонстрируются на свету для съемочных целей.

Для начала солюбилизации DM Nitro в 50 мкмольярных кучах буферизуют 100 мкмольяр хлорида калия, рН 7,0 до конечной концентрации 400 мкмоль. Добавьте хлорид кальция из 0,1 молярного раствора для достижения желаемого соотношения концентрации кальция и DN нитро. Далее растворяют эталонное соединение цианистый калий или хромат натрия в том же буфере.

Что касается примера, обратитесь к текстовому протоколу за схемой базовой экспериментальной конфигурации для отклонения фототермического луча. При постановке эксперимента проведите пробный луч через центр ячейки, помещенной в держатель ячейки с регулируемой температурой. Затем с помощью отверстия отрегулируйте диаметр пучка зонда с точностью до одного миллиметра, с помощью второго зеркала за образцом центрируйте луч пробника по центру чувствительного к положению детектора.

Сфокусируйте профессиональный луч на центре детектора так, чтобы разница в напряжении между двумя верхними диодами и двумя нижними диодами, а также разница в напряжении между двумя диодами с левой и правой стороны детектора была равна нулю. Затем сформируйте диаметр пучка накачки, 355 нанометровый выход ND YAG-лазера. С помощью трехмиллиметрового отверстия, расположенного между лазерными зеркалами с яркостью 2 355 нанометров, луч накачки распространяется через центр веты.

Важно, чтобы оба лазерных луча распространялись через центр оптической ячейки почти по колиновому принципу. Для получения измеримого угла отклонения и, следовательно, высокой амплитуды отклонения фототеплового луча или сигнала PBD используйте эталонное соединение для выравнивания пробника и пучка накачки для получения удовлетворительного сигнала PBD, характеризующегося хорошим отношением сигнал/шум и стабильной амплитудой PBD в более длительных временных масштабах. Затем расположите луч накачки по отношению к лучу зонда путем инкрементальной регулировки лазерных зеркал с яркостью 355 нанометров.

Измерьте амплитуду опорного сигнала PBD как разницу между двумя верхним и нижним фотодиодами на позиционно-чувствительном детекторе. Сигнал PBD должен демонстрировать быстрое увеличение амплитуды в быстром масштабе времени и оставаться стабильным в масштабе 100 миллисекунд. Проверьте линейность амплитуды сигнала PBD по отношению к выделяемой тепловой энергии, измерив линейную зависимость сигнала PBD от мощности лазера возбуждения, а также от числа поглощенных Эйнштейном.

Поддерживайте мощность лазера ниже примерно 1000 микроджоулей, чтобы предотвратить многофотонное поглощение. Кроме того, поддерживайте поглощение образца или эталонного соединения на длине волны возбуждения менее 0,5, чтобы предотвратить снижение мощности пучка накачки. Эти шаги обеспечат линейность сигнала PBD.

Начните с измерения кривых PBD. Для справки поместите раствор эталонного соединения в кварцевую ячейку и поместите ячейку в держатель с регулируемой температурой. Определение опорного сигнала PBD в зависимости от температуры в диапазоне температур от 16 до 35 градусов Цельсия с шагом температуры в три градуса Цельсия.

При каждом изменении температуры. Проверьте положение пробного луча на позиционно-чувствительном детекторе и отрегулируйте положение относительно центра детектора. При необходимости проверьте линейность сигнала PBD, как описано в текстовом протоколе.

Затем поместите раствор образца в ту же оптическую ячейку, которая использовалась для эталонного соединения, сохраняя ту же ориентацию оптической ячейки для эталонного измерения. Перейдите к обнаружению трасс PBD образца в том же температурном диапазоне, что и для эталона, и проверьте линейность амплитуды PBD образца. Примите амплитуду опорного сигнала PBD в качестве разницы между сигналом предварительного запуска и сигналом PBD после запуска.

Аналогичным образом определяют амплитуду быстрой и медленной фазы сигнала PBD выборки. Чтобы исключить параметр отклика прибора, масштабируйте амплитуду сигнала выборки PBD в соответствии с амплитудой сигнала PBD. Для справки, отношение сигнала образца к опорному сигналу дает уравнение, из которого можно определить выделение тепла в раствор и нетепловое изменение объема, связанное с реакцией, инициируемой фото, по наклону и пересечению графика отношения амплитуды, умноженного на энергию, от термозависимого члена для определения объема реакции и изменения энтальпии для масштаба быстрого и медленного процесса. Наблюдаемый объем и энтальпия изменяются на соответствующий квантовый выход.

В соответствии с уравнениями, найденными в текстовом протоколе, амплитуды и времена жизни для отдельных шагов анализируются путем подгонки данных к нестационарной функции, которая описывает изменения объема и энтальпии. Амплитуда быстрого шага соответствует амплитуде мгновенной фазы сигнала PBD выборки, а амплитуда последующего шага соответствует амплитуде медленной фазы сигнала PBD выборки. Для каждого отдельного процесса по температурной зависимости константы скорости для отдельных процессов параметры энтальпии активации и энтропии могут быть легко определены с помощью ИК-графиков.

Здесь показан репрезентативный пример следов PBD для фотовысвобождения кальция из нитро кальция DM. Быстрая фаза соответствует фоторасщеплению нитро кальция DM и высвобождению кальция, в то время как медленная фаза отражает связывание кальция с нефотоклеткой. Здесь показана трассировка PBD для ассоциации кальция с С-концевым доменом антагониста регуляторного элемента нейронного сенсора кальция, регулятора или сновидения при диссоциации кальциевой фотографии.

Фотография выпущенного лиганда связана с С-концевой областью сновидения с постоянной времени 1,3 плюс-минус 0,3 миллисекунды при 20 градусах Цельсия от температурной зависимости наблюдаемой константы скорости. Было определено, что активационный барьер для связывания кальция с С-концевым доменом сновидения составляет 9,2 плюс-минус 0,4 килокалорий на моль. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить об измерении пробных трасс PBD в условиях, идентичных тем, которые указаны в эталоне.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как подготовить образец, выровнять приборы и проанализировать данные для получения воспроизводимого термодинамического параметра.