Выделение сотовых липидные капли: Два Методы очистки Начиная с дрожжевых клеток и правам плаценты

Общая цель этой процедуры заключается в выделении липидных капель из ткани. Это достигается путем предварительного рассечения и отделения плацентарной ткани. Далее клетки олеина гомогенизируются.

Затем органеллы разделяются несколькими этапами центрифугирования. Наконец, собирают плавающий слой, содержащий липидные капли, и характеризуют липидные капли. В конечном счете, флуоресцентная микроскопия и западный анализ крови используются для того, чтобы показать чистоту фракции липидных капель.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что можно выделить липидные капли из большинства клеток аорты. Обратите внимание, что в некоторых тканях количество капель может быть ниже тех, которые уменьшают плавающий слой G и количество капель. Плаценты были собраны у здоровых женщин с одноплодной беременностью, перенесших плановое кесарево сечение до начала спонтанных родов в срок, которые дали письменное информированное согласие на забор плаценты.

Сбор и последующее использование плаценты было проведено с одобрения Университета Теннесси и Высшей школы медицины Университета Теннесси в Ноксвилле. Организационный наблюдательный совет в капюшоне биологической безопасности, переложить плаценту в стерильный автоклавируемый контейнер и тщательно смыть кровь с плаценты и оболочек с помощью стерильного физиологического раствора. Выбросьте кровавый солевой раствор в литровую мензурку как жидкие биологические отходы.

Поместите плаценту на стерильное поле так, чтобы эта гладкая поверхность держала пуповину вверх острыми ножницами и щипцами. Удалить пуповину и оболочки плода. Далее переверните плаценту так, чтобы материнская поверхность была обращена вверх.

Затем удалите вышележащую ткань базальной пластинки примерно в трех миллиметрах от поверхности. Препарируйте по одному свинцу COTA за раз, избегая хорионической пластины, и соберите ворсинчатую ткань в стакан объемом 250 миллилитров с физиологическим раствором. Затем с помощью 0,9% стерильного физиологического раствора и щипцов прополоскать ткань несколько раз в отдельной мензурке, поворачивая с помощью литрового стакана для жидких отходов.

Перекладывайте по одному коди-свинцу в 150-миллиметровую чашку Петри. Держите щипцами и с помощью бритвенного лезвия соскребите ткань из сосудов на чашку Петри. Поместите соскобленную салфетку в отдельную мензурку, содержащую 0,9% стерильного физиологического раствора.

Повторите для всех кусочков салфетки. После промывки соскобленной ткани в области диссоциации клеток сцедите ее от лишней жидкости и веса для переваривания плацентарной ткани. После приготовления смеси для переваривания тканей разделите ткань, передав 60 грамм от общего количества собранной ткани в стерильную колбу Хелен Мейер объемом 500 миллилитров.

Добавьте смесь для переваривания тканей в колбу, содержащую ткань, и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в шейкере в течение 45 минут. При 150 об/мин собрать диссоциированные клетки после инкубации и наклонить колбу, чтобы дать ткани осеть. Соберите супер натин.

Следите за тем, чтобы не собирать диссоциированную ткань UND. Добавьте равное количество HBSS в надосадочную жидкость перед переносом в стерильные центрифужные пробирки объемом 15 миллилитров. Повторите сбор диссоциации и надосадочной жидкости с оставшимися порциями ткани, ассоциированной с UND, для каждой партии после центрифугирования 1000 раз.

Под действием силы тяжести в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия отсасывайте надосадочную жидкость, не нарушая гранулы. Плацентарные ворсинчатые клетки находятся преимущественно в белой части гранулы, расположенной над эритроцитами. Переложите ворсинчатые клетки в белой части гранулы в стерильную коническую центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров и держите на льду.

После сбора клеток со всех трех стадий пищеварения используйте 100-микронный нейлоновый фильтр для клеток, вставленный в верхнюю часть стерильной конической центрифужной пробирки объемом 50 миллилитров, чтобы отфильтровать суспензию. Если фильтрация суспензии элемента замедляется, поднимитесь вверх по фильтру, чтобы создать вакуум внутри трубки, центрифуга при температуре четыре градуса Цельсия и в 1000 раз сильнее силы тяжести в течение 10 минут. Осторожно удалите надосадочную жидкость, не потревожив гранулу для гомогенизации клеток ворсин плаценты с использованием свежеприготовленной среды для гипотонического лизиса или HLM в биологически безопасном колпаке, добавьте в клетки в четыре раза больше объема клеточных гранул ледяного HLM.

Используйте пипетку объемом 10 миллилитров для аккуратного и тщательного восстановления. Подвешивайте клетки, пипетируя их вверх и вниз. После инкубации клеток на льду в течение 10 минут перенесите их в ледяной гомогенизатор и медленно гомогенизируйте клетки с помощью неплотно прилегающего пестика, нанеся от 20 до 25 легких движений.

Вращайте лизат со скоростью, в 3000 раз превышающей силу тяжести и четыре градуса Цельсия, в течение 10 минут, чтобы удалить неповрежденные клетки. Затем соберите надосадочную жидкость в новую пробирку, прежде чем снова вращать при скорости в 25 000 раз сильнее силы тяжести и четырех градусах Цельсия в течение 20 минут. Чтобы удалить митохондрии и изолировать липидные капли методом ультрацентрифугирования, соберите супернатин в 50-миллилитровую центрифужную пробирку.

Отрегулируйте до 20% сахарозы и перенесите на дно ультрацентрифужной пробирки для ротора S SW 28 или эквивалентного типа супер натин с примерно 10 миллилитрами ледяного холодного буфера, 100 миллимоларным буфером карбоната натрия и от 0,5 до одного миллилитра ледяного HLM для заполнения пробирки с помощью центрифуги с качающимся ротором ковша S SW 28 при температуре 130, 000 раз сила тяжести и четыре градуса Цельсия в течение 45 минут. Затем соберите плавающий слой, отрегулируйте до 10% сахарозы и перенесите его на дно ультрацентрифужной пробирки объемом 13,2 миллилитров для ротора SW 41 TI или эквивалентно наложите отрегулированную плотность надосадочную жидкость примерно пятью миллилитрами ледяного холодного буфера, 100 миллимолярным буфером карбоната натрия и 0,5 миллилитрами ледяного HLM после центрифугирования при 274. 000 раз сила тяжести и четыре градуса Цельсия в течение 60 минут. В роторе SW 41 TI с помощью пипетки объемом в один миллилитр осторожно соберите верхний плавающий слой, содержащий липидные капли.

Отрегулируйте объем до 10% сахарозы и снова переложите в ультрацентрифужную пробирку объемом 13,2 миллилитров перед тем, как покрыть пятью миллилитрами ледяного холодного буфера, 100 миллимолярным буфером карбоната натрия и 0,5 миллилитров ледяного HLM. После центрифугирования в течение 30 минут с помощью изогнутой полиэтиленовой пипетки осторожно соберите верхний белый плавающий слой, содержащий липидные капли, в три пробирки объемом 1,5 миллилитра, содержащие 100 микролитров HLM. Охарактеризовать липидные капли в соответствии с текстовым протоколом, как видно на этом рисунке, наличие липидных капель, выделенных из плацентарных ворсинчатых клеток человека, было подтверждено путем окрашивания нейтральным липидным специфическим флуоресцентным красителем boda P 4 93 5 0 3 и визуализировано с помощью флуоресцентной микроскопии.

На рисунке показано, что чистоту выделенных фракций липидных капель оценивали методом вестерн-блоттинга с использованием маркерных белков для липидных капель, которые включали паралиппин два кальнексина для er, маркер goi, GM 1 30 CO X 4 для митохондрий и плазматической мембраны, MEK один. После отшелушивания липидные капли с холодным ацетоном и белки экстрагируются. Фракции подвергали вестерн-блоттингу para lipin.

Во-вторых, белок липидной капли был обнаружен в постъядерном надосадочной жидкости и в изолированном белом плавающем слое, содержащем липидные капли. Белки, специфичные для плазматических мембран, таких как MK one и GM one 30, не были обнаружены во фракциях липидных капель ни в одном из слоев под плавающим слоем для спина 4 и спина 5. Как сообщалось ранее, белок кальнексин и слабое окрашивание белка митохондриальной мембраны CO X 4 были обнаружены в других местах фракции липидных капель.

Эти результаты согласуются с более ранними сообщениями, показывающими, что липидные капли взаимодействуют с митохондриями в клетках млекопитающих и с ER r. После этой процедуры могут быть применены другие методы, такие как протеомный и липидомный методы, для изучения дополнительных вопросов, например, какие факторы связаны с каплями.