Выделение сотовых липидные капли: Два Методы очистки Начиная с дрожжевых клеток и правам плаценты

Общая цель данной процедуры заключается в выделении липидных капель из ткани. Это достигается путем предварительного препарирования и отделения плацентарной ткани. Затем клетки олеина гомогенизируют.

Затем органеллы разделяют с помощью нескольких этапов центрифугирования. В завершение собирают плавающий слой, содержащий липидные капли, и проводят их характеристику. В конечном итоге для подтверждения чистоты фракции липидных капель используют флуоресцентную микроскопию и вестерн-блот-анализ.

Главным преимуществом данного метода является возможность выделения липидных капель из большинства клеток аорты. Следует отметить, что в некоторых тканях количество капель может быть ниже, что приводит к уменьшению плавающего слоя G и общего числа капель. Плаценты были собраны у здоровых женщин с одноплодной беременностью, перенесших плановое кесарево сечение до начала спонтанных родов на доношенном сроке; испытуемые предоставили письменное информированное согласие на забор плаценты.

Сбор и последующее использование плацент проводились с одобрения Университета Теннесси и Высшей школы медицины Университета Теннесси в Ноксвилле. Институционального наблюдательного совета. В шкафу биологической безопасности перенесите плаценту в стерильный автоклавируемый контейнер и тщательно промойте плаценту и оболочки от крови, используя стерильный физиологический раствор. Слейте окрашенный кровью раствор в однометральный стакан в качестве жидких биологических отходов.

Поместите плаценту на стерильное поле гладкой поверхностью с пуповиной вверх, используя острые тонкоконечные ножницы и пинцет. Удалите пуповину и плодные оболочки. Затем переверните плаценту так, чтобы материнская поверхность была обращена вверх.

Затем удалите ткани базальной пластинки, находящиеся над поверхностью, примерно на три миллиметра. Поочередно препарируйте каждый ведущий сосуд COTA, избегая повреждения хориональной пластинки, и помещайте ворсинчатую ткань в стакан объемом 250 миллилитров с физиологическим раствором. Затем, используя 0,9% стерильный физиологический раствор и пинцет, несколько раз промойте ткань в отдельном стакане круговыми движениями, сливая отработанную жидкость в стакан объемом один литр.

Переносите по одному заготовку коди в чашку Петри диаметром 150 мм. Удерживая заготовку пинцетом, с помощью лезвия бритвы соскребите ткани с сосудов в чашку Петри. Поместите соскребленные ткани в отдельный стакан с 0,9% стерильным физиологическим раствором.

Повторите процедуру для всех фрагментов ткани. После промывания соскребленной ткани в растворе для диссоциации клеток слейте излишки жидкости и взвесьте плацентарную ткань для последующего переваривания. После приготовления смеси для диссоциации ткани разделите ее, перенеся 60 г от общего объема собранной ткани в стерильный флакон Хенка-Мейера объемом 500 мл.

Добавьте смесь для переваривания ткани в колбу с тканью и инкубируйте при 37 °C в шейкере в течение 45 минут. При 150 RPM соберите диссоциированные клетки после инкубации, наклонив колбу, чтобы ткань осела. Соберите супернатант.

Следите за тем, чтобы не собрать недиссоциированную ткань UND. Перед переносом в стерильные центрифужные пробирки объемом 15 мл добавьте к супернатанту равный объем HBSS. Повторите процедуру диссоциации и сбора супернатанта с оставшимися порциями ассоциированной с UND ткани для каждой партии после центрифугирования при 1000 ×g.

Центрифугируйте в течение 15 минут при температуре 4 °C, затем аспирируйте супернатант, не затрагивая осадок. Клетки ворсин плаценты сосредоточены преимущественно в белой части осадка, расположенной над эритроцитами. Перенесите клетки ворсин из белой части осадка в стерильную коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл и держите на льду.

После сбора клеток со всех трех этапов переваривания профильтруйте суспензию через нейлоновый фильтр для клеток с размером пор 100 микрон, вставленный в верхнюю часть стерильной конической центрифужной пробирки объемом 50 миллилитров. Если скорость фильтрации клеточной суспензии снижается, приподнимите фильтр, чтобы создать в пробирке вакуум, затем центрифугируйте при температуре четырех градусов Цельсия и 1000 ×g в течение 10 минут. Осторожно удалите супернатант, не затрагивая осадок, чтобы гомогенизировать клетки ворсин плаценты в боксе биологической безопасности, используя свежеприготовленную гипотоническую среду для лизиса или HLM; добавьте к клеткам ледяную HLM в объеме, в четыре раза превышающем объем клеточного осадка.

Используйте пипетку на 10 миллилитров, чтобы аккуратно и тщательно ресуспендировать клетки, перенося их из одного конца пробирки в другой. После инкубации клеток на льду в течение 10 минут перенесите их в охлажденный гомогенизатор и медленно гомогенизируйте клетки с помощью пестика со свободным прилеганием, совершив от 20 до 25 осторожных движений.

Центрифугируйте лизат при 3000 ×g и температуре 4 °C в течение 10 минут для удаления неразрушенных клеток. Затем перенесите супернатант в новую пробирку и повторно центрифугируйте при 25 000 ×g и температуре 4 °C в течение 20 минут. Чтобы удалить митохондрии и выделить липидные капли методом ультрацентрифугирования, соберите супернатант в центрифужную пробирку объемом 50 мл.

Доведите концентрацию сахарозы до 20% и перенесите раствор на дно пробирки для ультрацентрифуги, подходящей для ротора S SW 28 или эквивалентного; нанесите поверх супернатанта с отрегулированной плотностью около 10 миллилитров ледяного 100 миллимолярного натрия карбонатного буфера и от 0,5 до 1 миллилитра ледяного HLM, чтобы заполнить пробирку. Центрифугируйте с использованием центрифуги с ротором S SW 28 с маятниковыми стаканами при 130 000 ×g и температуре четыре градуса Цельсия в течение 45 минут. Затем соберите плавающий слой, доведите концентрацию сахарозы до 10% и перенесите его на дно пробирки для ультрацентрифуги объемом 13,2 миллилитра, подходящей для ротора SW 41 TI или эквивалентного; нанесите поверх супернатанта с отрегулированной плотностью около пяти миллилитров ледяного 100 миллимолярного натрия карбонатного буфера и 0,5 миллилитра ледяного HLM. Центрифугируйте при 274 000 ×g и температуре четыре градуса Цельсия в течение 60 минут. В роторе SW 41 TI с помощью дозатора на один миллилитр осторожно соберите верхний плавающий слой, содержащий липидные капли.

Доведите объем 10% сахарозы до нужного значения и снова перенесите содержимое в ультрацентрифужную пробирку объемом 13,2 мл, после чего нанесите сверху пять миллилитров ледяного 100 мМ карбоната натрия буфера и 0,5 мл ледяного HLM. После центрифугирования в течение 30 минут с помощью изогнутого PE-дозатора осторожно соберите верхний белый плавающий слой, содержащий липидные капли, в три пробирки по 1,5 мл, содержащие 100 мкл HLM. Охарактеризуйте липидные капли согласно текстовому протоколу, представленному на этом рисунке; наличие липидных капель, выделенных из клеток ворсин плаценты человека, было подтверждено окрашиванием специфическим флуоресцентным красителем для нейтральных липидов boda P 4 93 5 0 3 и визуализировано с помощью флуоресцентной микроскопии.

Здесь показана оценка чистоты изолированных фракций липидных капель методом вестерн-блоттинга с использованием маркерных белков: перилипина 2 для липидных капель, кальнексина для ЭР, маркера аппарата Гольджи GM130, COX IV для митохондрий и плазматической мембраны, а также MEK1. После делипидации липидных капель холодным ацетоном белки были экстрагированы. Фракции были подвергнуты вестерн-блоттингу на перилипин.

Во-вторых, белок липидных капель был обнаружен в постнуклеарном супернатанте и в изолированном белом плавающем слое, содержащем липидные капли. Белки, специфичные для плазматических мембран, такие как MK one и GM one 30, не были обнаружены во фракциях липидных капель ни в слое под плавающим слоем для spin four, ни для spin five. Как сообщалось ранее, белок калнексин и слабое окрашивание белка митохондриальной мембраны CO X four были обнаружены в других случаях во фракции липидных капель.

Эти результаты согласуются с более ранними данными, показывающими, что липидные капли взаимодействуют с митохондриями в клетках млекопитающих и с ЭПР. После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как протеомный и липидомный анализ, для изучения дополнительных вопросов, например, о том, какие факторы связаны с каплями.