Внутримямфотовая инъекция узлов биоразлагаемых полимерных частиц

Общая цель данной процедуры заключается в доставке вакцинных частиц из биоматериала в лимфатические узлы с помощью метода прямого введения. Сначала синтезируйте липидно-стабилизированные полимерные частицы методом двойной эмульсии. Затем промойте частицы и измерьте такие свойства материала, как размер, содержимое, эффективность загрузки или стабильность.

Затем в основание хвоста мыши введите краситель-трассер, чтобы обеспечить визуализацию после его дренирования в лимфатический узел. Заключительным этапом является идентификация помеченного красителем лимфатического узла и инъекция небольшого объема полимерных частиц в это место. Для подтверждения наличия и распределения частиц в паховых лимфатических узлах можно использовать гистологию, иммунофлуоресценцию и конфокальную микроскопию.

Сочетание прямой инъекции в лимфатические узлы с использованием биоматериалов для вакцинации обеспечивает строгий контроль над составом и дозами компонентов вакцины в микроокружении лимфатического узла, а также позволяет осуществлять контролируемое высвобождение активных веществ в этих тканях. Для достижения эффективности все вакцины должны попадать в лимфатические узлы. Таким образом, определение того, как биоматериалы и включенные в них иммунные стимулы влияют на локальную сигнализацию в лимфатических узлах, имеет важное значение для установления связи между этими событиями и системным иммунным ответом.

Эти знания помогут нам лучше понять принципы функционирования вакцин на основе биоматериалов, вводимых традиционными путями. Хотя доставка биоматериалов непосредственно в лимфатический узел служит инструментом изучения их влияния на организацию лимфоузлов, данная платформа также предоставляет прикладную возможность для разработки новых терапевтических вакцин и методов иммунотерапии, направленных на лечение рака и аутоиммунных заболеваний. Для получения микрочастиц подвергните органическую фазу, содержащую полимер, липид и другие нерастворимые в воде компоненты, воздействию ультразвука на льду при мощности 12 watts.

Для создания эмульсии воды и масла добавьте 500 µL дистиллированной H2O или H2O, содержащей 1 mg пептидного белка или другого водорастворимого груза. Продолжайте перемешивание в течение 30 секунд. Осторожно покачивайте флакон вверх-вниз и из стороны в сторону вокруг наконечника смесителя для обеспечения полной эмульгации.

Теперь приготовьте эмульсию масла в воде, влив эмульсию масла и воды в 40 миллилитров H2O и гомогенизируя смесь в течение трех минут при 16 000 RPM. Затем добавьте магнитный перемешиватель и перемешивайте эмульсию масла в воде в течение ночи для удаления избытка растворителя после ночного удаления растворителя. Пропустите эмульсию через нейлоновое сито с ячейками 40 микрон в коническую центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров и центрифугируйте в течение пяти минут, слейте супернатант, ресуспендируйте осадок частиц в одном миллилитре воды и перенесите суспендированные частицы в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра.

Осадите частицы путем центрифугирования в течение пяти минут. Измерьте размер частиц методом лазерной дифракции или светорассеяния. Убедитесь, что объем воды, добавленной в кювету, достаточен для юстировки и проведения холостого измерения. Пипеткой внесите 10 µL суспензии частиц в кювету.

Закройте дверцу отсека анализатора размеров частиц. Затем измерьте размер частиц PLGA. Используйте показатель преломления 1.60.

Используйте интерфейс программного обеспечения для расчета диаметра частиц по количественному основанию за один день до инъекции. Проведите анестезию мыши в соответствии с протоколом работы с животными, утвержденным IACUC. Оцените глубину анестезии с помощью теста на щекотку пальца лапы.

Проверьте щипковый рефлекс и проконтролируйте дыхание, чтобы убедиться, что частота дыхания составляет от 100 до 120 вдохов в минуту. Выбрейте шерсть у основания хвоста и на задней четверти. Удалите шерсть с вентральной стороны животного и латерально до дорсальной стороны чуть выше сустава задней ноги.

Для каждого введения красителя с помощью микропипетки перенесите 10 µL раствора красителя в микроцентрифужную пробирку, затем наберите все 10 µL через иглу калибра 31 в инсулиновый шприц объемом 1 мл. Подкожно введите по 10 µL раствора красителя с каждой стороны основания хвоста, соблюдая интервалы между инъекциями. Для удаления оставшихся волосков нанесите мягкий крем для депиляции.

Обязательно нанесите средство на область между задней конечностью и брюшком. Через три минуты, используя влажную руку в перчатке, смоченную в теплой H₂O, осторожно вотрите депиляционный крем в кожу. Повторите процедуру немедленно, чтобы удалить остатки депилятора.

Затем смочите мягкую ткань или бумажное полотенце теплой водой и одним движением протрите нижнюю часть мыши. Поместите мышь под инфракрасную лампу для восстановления, после чего верните ее в клетку минимум на 12 часов. Осмотрите анестезированную мышь, чтобы подтвердить дренаж следа или красителя в каждый паховый лимфатический узел.

Лимфатический узел должен быть виден в виде темного пятна рядом с задним бедром и брюшной полостью. Теперь повторно суспендируйте частицы в дистиллированной воде до требуемой концентрации для каждой инъекции. Используйте микропипетку, чтобы перенести 10 µL раствора частиц в микроцентрифужную пробирку.

Отоберите все 10 µL с помощью инсулиновой иглы 31G, прикрепленной к шприцу объемом 1 мл. Натяните кожу вокруг окрашенного лимфатического узла, удерживая иглу под углом 90° к поверхности кожи. Проколите кожу на глубину 1 мм.

Медленно введите весь объем, наблюдая за видимым увеличением лимфатических узлов. Дайте мыши восстановиться под греющей лампой, после чего верните её в помещение для содержания или проведите дополнительные тесты. Сначала подтвердите синтез частиц и распределение их по размеру.

Протокол синтеза методом испарения растворителя из эмульсии можно качественно оценить путем визуального осмотра конечных эмульсий. Эмульсии должны представлять собой гомогенную суспензию без видимых агрегатов. Распределение частиц по размеру можно подтвердить методом лазерной дифракции или динамического рассеяния света; образцы частиц должны демонстрировать мономодальное распределение.

Дальнейшая качественная оценка синтеза частиц может быть проведена путем модификации протокола с целью включения одного или нескольких флуоресцентных маркеров, таких как флуоресцентный пептид или липофильный краситель. Краситель может быть использован для локализации и нацеливания лимфатического узла для инъекции частиц. В ходе обучения мышей могут быть подвергнуты эвтаназии с последующим некропсии после инъекции красителя для ознакомления с расположением лимфатических узлов. Распределение частиц в зонах t- и b-клеток инфицированного лимфатического узла подтверждается с помощью конфокальной микроскопии срезов окрашенных лимфатических узлов.

Различия в свойствах частиц, таких как размер, можно наблюдать в лимфатических узлах после инъекции и визуализации с помощью флуоресцентной микроскопии. После освоения эту методику можно выполнить за два дня. Синтез частиц и подготовка животных осуществляются в первый день. Промывка и характеристика частиц, а также инъекция в лимфатический узел проводятся во второй день.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как использовать трейсер или краситель для визуализации и инъекции в паховые лимфатические узлы мышей. Эта методика обеспечивает нехирургическую доставку биоматериалов-носителей вакцин непосредственно в лимфатический узел с уровнем контроля, который ранее был недоступен. Прямая доставка биоматериалов в лимфатические узлы позволит ученым и инженерам в области иммунологии и разработки вакцин изучить фундаментальные взаимодействия вакцин на основе биоматериалов и иммунных сигналов с лимфатическим узлом, проливая новый свет на механизмы, с помощью которых эти материалы стимулируют иммунитет и формируют его.