Внутримямфотовая инъекция узлов биоразлагаемых полимерных частиц

Общая цель этой процедуры заключается в депонировании частиц биоматериала вакцины в лимфатические узлы с помощью техники прямой инъекции. Во-первых, синтезируют стабилизированные липидами полимерные частицы методом двойной эмульсии. Затем промойте частицы и измерьте свойства материала, такие как размер, груз, нагрузка или устойчивость.

Затем введите индикаторный краситель в основание хвоста мыши, чтобы обеспечить визуализацию после дренажа красителя в лимфатический узел. Заключительным этапом является идентификация меченого D лимфатического узла и введение небольшого объема полимерных частиц в это место. Гистология, иммунофлюоресценция и конфокальная микроскопия могут быть использованы для подтверждения наличия и распределения частиц в паховых лимфатических узлах.

Сочетание прямого введения лимфатических узлов с биоматериалами для вакцинации позволяет жестко контролировать комбинации и дозы компонентов вакцины в микроокружении лимфатических узлов, а также позволяет контролировать высвобождение груза в этих тканях. Чтобы быть эффективными, все вакцины должны достигать лимфатических узлов. Таким образом, определение того, как биоматериалы и включенные иммунные сигналы влияют на передачу сигналов в местных лимфатических узлах, важно для связи этих событий с системным иммунным ответом.

Эти знания помогут нам лучше понять, как функционируют биоматериальные вакцины, вводимые традиционными путями. Несмотря на то, что внутрилимфатическая доставка биоматериалов служит инструментом для изучения влияния биоматериалов на организацию лимфатических узлов, эта платформа также предоставляет прикладную возможность для разработки новых терапевтических вакцин и иммунотерапий, направленных на лечение рака и аутоиммунных заболеваний. Для микрочастиц ультразвука, органической фазы, содержащей полимер липид и другие нерастворимые в воде грузы на льду мощностью 12 Вт.

Для создания водно-масляной эмульсии добавьте 500 микролитров дистиллированной H2O или H2O, содержащей один миллиграмм пептидного белка или другого водорастворимого груза. Продолжайте блуд в течение 30 секунд. Осторожно покачивайте флакон вверх и вниз из стороны в сторону вокруг наконечника атора, чтобы обеспечить полное эмульгирование.

Теперь приготовьте воду и масло в водной эмульсии, заливая водно-масляную эмульсию в 40 миллилитров гомогенизированной H2O в течение трех минут при 16 000 об/мин. Затем добавьте магнитную мешалку и перемешайте воду и масло в водной эмульсии в течение ночи, чтобы удалить избыток растворителя после ночного удаления растворителя. Налейте эмульсию через нейлоновое сетчатое сетчатое сетчатое сетчатое фильтр 40 микрон в центрифугу с конической трубкой объемом 50 миллилитров на пять минут, сцедите надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу частиц в одном миллилитре воды и перенесите взвешенные частицы в микроцентрифугу объемом 1,5 миллилитров.

Соберите частицы путем пятиминутного центрифугирования. Измеряйте размер частиц с помощью лазерной дифракции или рассеяния света. При этом объем воды, добавляемой во фракционную ячейку, находится на достаточном уровне для выравнивания и гашения пипеткой 10 микролитров частиц суспензии в ячейку фракции.

Закройте дверцу отсека для анализатора размера частиц. Затем измерьте размер частиц для PLGA. Используйте показатель преломления 1,60.

Используйте интерфейс программного обеспечения для расчета диаметра частиц на основе чисел за день до впрыска. Обезболите мышь в соответствии с протоколом для животных, одобренным IACUC. Оцените глубину анестезии с помощью пальца ноги.

Щипковые рефлекторные тесты и контроль дыхания, чтобы обеспечить частоту дыхания от 100 до 120 вдохов в минуту. Сбрейте шерсть у основания хвоста и задней четверти. Удалите шерсть с брюшной стороны животного и сбоку вокруг спинной стороны прямо над суставом задней ноги.

Для каждой инъекции красителя используйте микропипетку, чтобы перенести 10 микролитров раствора красителя в микроцентральную фуге-пробирку и аспирировать все 10 микролитров через иглу 31 калибра в инсулиновый шприц объемом один миллилитр. Теперь введите по 10 микролитров раствора красителя подкожно с каждой стороны основания хвоста для загрузки между инъекциями. Нанесите мягкий крем для депиляции, чтобы удалить оставшиеся волосы.

Обязательно обмажьте область между задней лапой и животом. Через три минуты используйте влажную руку в перчатке с теплым Н два о и аккуратно вотрите крем для депиляции в кожу. Немедленно повторите, чтобы удалить излишки депилятора.

Далее намочите мягкую ткань или бумажное полотенце теплой водой и одним движением протрите нижнюю часть мышки. Поместите мышь под нагревательную лампу, чтобы она восстановилась, а затем верните ее в режим удержания не менее чем на 12 часов. Осмотрите мышь, находящуюся под наркозом, чтобы подтвердить отток следов или красителя в каждый паховый лимфатический узел.

Лимфатический узел должен быть виден в виде темного пятна возле заднего бедра и живота. Теперь ресуспендирование частиц в дистиллированной воде при требуемой концентрации впрыска для каждого впрыска. С помощью микропипетки переведите 10 микролитров раствора частиц в микроцентрифужную пробирку.

Аспирируйте все 10 микролитров в иглу инсулина 31 калибра, прикрепленную к одномиллилитровому шприцу. Натяните кожу вокруг окрашенного лимфатического узла иглой под углом 90 градусов к коже. Проникайте в кожу на глубину до одного миллиметра.

Медленно вводите мониторинг всего объема для видимого увеличения лимфатических узлов. Дайте мыши восстановиться под действием тепловой лампы, а затем вернитесь в режим удержания или проведите дополнительное тестирование. Во-первых, подтвердите синтез частиц и распределение по размерам.

Протокол синтеза испарения эмульсии растворителем может быть качественно оценен путем визуального осмотра конечных эмульсий. Созданный. Эмульсии должны представлять собой однородную суспензию, свободную от видимых агрегатов. Распределение частиц по размерам может быть подтверждено с помощью лазерной дифракции или динамического рассеяния света: образцы частиц должны демонстрировать мономодальное распределение.

Дальнейшая качественная оценка синтеза частиц может быть достигнута путем модификации протокола с целью включения в него одного или нескольких флуоресцентных грузов, таких как флуоресцентный пептид или липофильный краситель. Краситель может быть использован для определения местоположения и нацеливания на лимфатический узел для инъекции частиц Во время тренировки мышей могут усыплять и проводить вскрытие после введения красителя, чтобы получить представление о расположении лимфатических узлов. Распределение частиц в Т- и В-клеточных зонах инфицированного лимфатического узла подтверждается конфокальной микроскопией разрезанных и окрашенных лимфатических узлов.

Различия в свойствах частиц, таких как размер, могут наблюдаться в лимфатических узлах после инъекции и визуализации с помощью флуоресцентной микроскопии. Синтез частиц и подготовка животных происходят в первые сутки. Определение характеристик промывки частиц и инъекция внутрилимфатических узлов проводятся на второй день.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как можно использовать след или краситель для визуализации и введения паховых лимфатических узлов мышей. Эта методика позволяет безоперационным путем доставлять биоматериальные носители вакцины непосредственно в лимфатический узел с уровнем контроля, который ранее был невозможен. Прямая доставка биоматериалов в лимфатические узлы позволит ученым и инженерам, а также иммунологам и разработчикам вакцин изучить фундаментальные взаимодействия биоматериалов, вакцин и иммунных сигналов с лимфатическими узлами, проливая новый свет на механизмы, с помощью которых эти материалы стимулируют и формируют иммунитет.